酵母双杂交ad和bd质粒的构建-8846威尼斯

    酵母双杂交（y2h）是快速鉴定蛋白质相互作用关系的实验方法。在进行酵母双杂交实验时，需要构建两个表达融合蛋白的质粒，即ad（activation domain）和bd（binding domain）质粒。以下是一般的构建步骤：

    选择适当的载体：ad和bd质粒均需要选择带有对应标签的适当载体，常见的包括pact和pgadt7（ad载体），pbridge和pgbkt7（bd载体）。选择不同载体的目的是方便后续配子。

    克隆目标序列：将目标蛋白的编码区域克隆入对应载体的多克隆位点中。需要注意的是，为了避免原有的识别序列对融合蛋白的稳定性产生影响，一般会选择仅包括开放阅读框（orf）的dna序列或重组两段dna序列的方式进行克隆。

    检查克隆结果：将克隆产物pcr扩增检测，确认目标序列已成功克隆。

    进行序列鉴定：将克隆产品进行sanger测序或深度测序，确保克隆的完整性和准确性。

    构建融合蛋白质粒：将检测合格的目标序列与所选载体重组拼接，构建ad和bd质粒。

    质粒测序：对构建后的ad和bd质粒进行再次测序，以确认正确构建。

    酵母双杂交实验需要避免假阳性结果的出现。因此，在选择目标序列时应优先选择已经验证或公认的蛋白质相互作用关系；同时还应注意采用合适的对照质粒，如空载体、负对照蛋白等，确保实验结果的可靠性。