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如何构建慢病毒稳转株
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-09-18 14:44
构建稳定细胞系的基本原理是将外源dna克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含抗性基因进行筛选。最常用的真核表达载体抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)。常用g418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。
慢病毒感染方法筛选单克隆是目前主流的稳定细胞系筛选方法。慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间稳定表达。因此，慢病毒常用于制备稳定表达、沉默特定基因的单克隆细胞株。
特点及优势
1. 长期在细胞中研究基因的功能（>2周）；
2. 使用诱导表达系统，这主要是由于：a)过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素；b)目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。
3. 动物实验，需将细胞注射到动物体内；
4. 构建工具细胞（生产、研究、筛选）。
| 慢病毒表达系统 | 特点 |
| 病毒类型 | rna逆转录病毒 |
| 能否自主复制 | 否 |
| 能否自行扩增 | 需要特殊包装系统和包装环境 |
| 是否整合 | 是，病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因 |
| 克隆容量 | 可插入不超过8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低 |
| 感染细胞类型 | 感染绝大多数细胞，包括分裂期、非分裂期细胞 |
| 表达时间 | 慢（2-4 天） |
| 表达丰度 | 中等水平 |
| 滴度 | 可达108－1010tu/ml |
| 免疫原性 | 低免疫原性 |
| 基因过表达 | 包装容量有限，过表达的基因过大时，病毒滴度受到影响 |
| microrna过表达 | 适合，是过表达microrna实验的首选工具 |
| rnai | 适合，是rnai实验的首选工具 |
| 下调microrna | 有报道 |
流程及注意事项
1. 慢病毒载体构建，过表达载体或者干扰载体构建
慢病毒过表达载体有基因容量限制，对于大于5k的基因，包装出慢病毒的概率很低，不建议包装病毒。同时大于3k的目的基因也可能有不出毒或者出毒量低，在做正式实验之前，可用先进行病毒的小量包装，成功后再进行病毒大量包装。对于敲低，通常的策略是对一个基因同时选择3个干扰靶点，通过qpcr验证干扰效率之后，使用效率最好的靶点进行下一步实验。
慢病毒载体带有不同的标签，如果研究细胞定位，可以选择带荧光标签的慢病毒载体，比如带gfp/rfp等；如果准备筛选稳转细胞株，可以选择带筛选标签的慢病毒载体，比如puro/neo等载体；如果目的基因大小适中，也可以选择同时带荧光标签和筛选标签的载体。
2. 293t细胞培养及慢病毒包装
细胞的状态对于病毒包装有很大的影响，如果细胞状态不好可能不出毒或者出毒量很低。取状态良好，处于对数生长期的293t细胞进行慢病毒包装。第三代四质粒包装质粒配比，可以按照分子量来折算，并在附近量做实验，摸索最适质粒配比，以得到更高滴度的病毒。
3. 慢病毒滴度检测及保存，使用荧光梯度稀释法或者qpcr法检测
慢病毒表达时间较慢，荧光表达所需时间较长，建议感染后72小时后观测荧光表达或者qpcr检测。感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液，以保证细胞良好的生长状态。值得考虑的是使用低浓度的血清来培养细胞，作用是抑制细胞增殖。
特别注意，慢病毒可以存放于-80℃6个月以上，但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前重新滴定病毒滴度。反复冻融会降低病毒滴度，每次冻融会降低病毒滴度10%，因此，在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，强烈建议收到病毒后按照每次的使用量将病毒进行分装。
4. 目的细胞moi值摸索，确定最适慢病毒感染复数
同一种细胞在不同实验室中由于传代次数、操作细节的不同，细胞状态会有所差异，另一方面病毒液在运输、保存过程中可能造成即时滴度的变化。因此为了达到最佳的实验效果，建议在正式实验前进行3-4种不同moi的感染预实验。细胞汇合度对抗生素筛选结果的影响很大，一般筛选时细胞汇合度不宜超过50%。
5. 目的细胞药物筛选浓度确定-通过梯度实验
使用不同浓度的抗生素对细胞进行处理，选择出在10-14天内使细胞全部死亡的最低抗生素浓度来进行下一步的筛选试验。不同的细胞对于同一种抗生素，其筛选浓度不同，而同一种细胞对于不同的抗生素，其最佳使用浓度也不同。所以在进行稳转株筛选之前，一定要先进行药物浓度筛选预实验以确定最佳药物筛选浓度。
6. 慢病毒感染目的细胞及多/单克隆稳转株筛选
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质，所以筛选不能太早，但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆。一般在转染24小时之后才开始加抗生素记性筛选。加药筛选后，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有抗生素表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液。
7. 慢病毒稳转株检测，通过qpcr或者western blot检测目的基因
需要注意的是，mrna的表达水平可能和蛋白的表达水平不一致，如果需要进一步研究蛋白的功能，可以使用wb检测蛋白的表达水平。
慢病毒包装流程
案例展示
1 慢病毒稳转株荧光检测
2 干扰慢病毒稳转株qpcr检测（3保1）
3 过表达慢病毒稳转株western blot检测（4株不同细胞）