技术专题
蛋白质组学研究在豆科植物苜蓿和其共生的固氮根瘤菌的研究
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-09-10 16:45
题目：a proteomic atlas of the legume medicago truncatula and its nitrogen-fixing endosymbiont sinorhizobium meliloti
豆科植物苜蓿和其共生的固氮根瘤菌的蛋白质组学研究
期刊：nature biotechnology
影响因子：35.724
主要技术：label free，tmt，修饰蛋白质组学
研究背景
豆科植物和共生的根瘤菌发生固氮作用可以从空气中获得氮，减少植物对土壤肥料的需求。为了进一步研究豆科植物与根瘤菌之间的共生关系，作者利用定量蛋白质组学和修饰组学，深入研究分析苜蓿与根瘤菌的蛋白表达谱，揭示蛋白质翻译后修饰在共生关系中的重要作用。
研究内容及结果
1. 蒺藜苜蓿及苜蓿中华根瘤菌蛋白质组学和翻译后修饰组学鉴定结果
作者为了研究蒺藜苜蓿（medicago truncatula）的综合蛋白质组学，选择了七个主要器官：根、茎、叶、花、种子、顶端分生组织（芽）、不同发育阶段的根瘤，分别取样后进行蛋白质组学分析（label free 和ptms）（图1）。随后，作者又整合、构建了苜蓿的非冗余蛋白质序列数据库（wisconsin medicago group，wmg）用于搜库检索。为了确定部分蛋白是来自根瘤菌还是苜蓿，作者又将根瘤菌的uniprot数据库和wmg数据库整合在一起，进行搜库分析。在本次研究中，总共鉴定到23013个蛋白，其中苜蓿19679个，根瘤菌3334个，修饰蛋白组学分析发现20120个磷酸化位点和734个乙酰化位点。
图1 蛋白质组学实验设计
2. 蛋白质表达谱分析
为了研究苜蓿全局蛋白表达情况，作者进行了环形蛋白质组学图谱分析（cpm，图2）。发现有一批核心蛋白质（5701个蛋白）在苜蓿所有部位均表达（图2a黑色直方图，图3a），翻译后修饰位点也较为集中于这些核心蛋白质组，它们主要参与蛋白质折叠、转运、翻译、糖酵解、糖异生等（图3b）。而且这批核心蛋白在各个器官中的表达也具有相似性（图3c）。除此之外，在根瘤所有时间节点都表达的蛋白共有2831个（图2b）。
图2 环形蛋白组学图谱
图3 不同器官的蛋白质组学结果
3. 核心蛋白质组的翻译后修饰
作者进一步研究了不同器官蛋白的翻译后修饰，发现翻译后修饰位点也较为集中于这些核心蛋白质组，比如根瘤中。细菌依靠宿主植物提供有机酸（主要是苹果酸），以产生固定大气氮所需的atp，而在核心蛋白质组中，苹果酸脱氢酶磷酸化水平增加，表明在结节成熟过程中磷酸化具有调节作用。此外，作者在固氮过程中nifh、ferredoxin iii、nifx等细菌蛋白发生了磷酸化修饰，并且固氮酶α链和nifh等蛋白发生了乙酰化修饰。这些关键蛋白的翻译后修饰可能在固氮调节中发挥重要作用。
图4 ptms 统计分析
4. m. truncatula 蛋白质功能分析及构建共表达网络
作者利用方差分析、层次聚类以及基因本体富集分析进行蛋白质共表达、修饰共调控的机制研究，结合蛋白结构域和序列分析实现了几种未表征的蛋白质和预测的基因产物假定功能注释（图5）。作者进一步用统计分析火山图揭示根瘤生长过程相关蛋白差异表达，这些蛋白的磷酸化修饰也发生了改变（图6a）。为了研究共生关系中发挥重要作用的蛋白，作者对根瘤组织中差异蛋白继续进行分析，利用已有的转录组和蛋白质组数据构建了共表达网络。作者发现，丝氨酸激酶和细胞壁相关激酶是共生网络中发挥重要作用的蛋白，钙调蛋白具有最高的连通程度，是宿主中关键的调节因子（图6）。
图5 m. truncatula蛋白功能注释
图6 差异蛋白火山图和蛋白网络调控预测分析
作者随后对鉴定到的252个结瘤特异性的富半胱氨酸肽（ncr）在根瘤发育过程中的表达模式进行统计分析，研究发现ncr多肽在结瘤过程中发挥重要功能：早期能够调控根瘤形态发生，后期可以调控共生体形成（图7a）。为了研究这些ncr多肽的靶点，作者接下来分析了s. meliloti蛋白质组学结果，研究发现，ncr多肽可靶向调节转录调节因子（arac、rpir、lysr、tetr、gntr、luxr）的特定蛋白质家族、与细胞分裂相关的蛋白质（ftsz，ftsw）和rna聚合酶辅助因子（图7b）。
图7 ncr表达模式及网络互作分析
5. 其他植物多肽和信号肽酶
除了上述ncr肽之外，作者还鉴定到了许多的短肽（<20个氨基酸），这些肽可能在发育、细胞-细胞通讯、免疫反应和共生中具有关键作用。同时，作者研究定位到两个信号肽酶（dnf1、a signal peptide peptidase-like protein）和两个关键肽转运蛋白（mtn21、ptr1）。作者认为深入研究这些多肽将有助于解析共生固氮的机理。
文章小结
作者在已有的苜蓿基因组和转录组数据的基础上对苜蓿大部分器官（根、茎、叶、花、种子、顶端分生组织以及不同发育阶段的根瘤）进行蛋白质组和修饰蛋白质组分析。研究鉴定到了苜蓿核心蛋白质组和参与根瘤生长及调控的特异蛋白子集，建立共生固氮调控网络，发现核心蛋白，为分析苜蓿与固氮根瘤菌的蛋白表达和蛋白翻译后修饰提供了新的研究思路，推动了根瘤固氮机理的研究。
解析文献
marx h, minogue ce , et al. a proteomic atlas of the legume medicago truncatula and its nitrogen-fixing endosymbiont sinorhizobium meliloti. nature biotechnology, 2016 , 34 (11) :1198
参考文献
1. wenger, c.d., phanstiel, d.h., et al. compass:a suite of pre- and post-search proteomics software tools for omssa. proteomics, 2011, 11, 1064–1074 .
2. marx, h., lemeer, s., et al. mscdb: a mass spectrometry-centric protein sequence database for proteomics. j. proteome res. 2013, 12, 2386–2398.
3. cox, j. et al. accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed maxlfq. mol. cell. proteomics, 2014, 13, 2513–2526 .
4. tyanova, s. et al. the perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. nat. methods, 2016, 13, 731–740.