技术专题
双荧光素酶报告基因的应用，常见载体及案例简介
文章来源：未知
作者：genecreate
发布时间：2022-11-01 14:31
双荧光素酶报告基因检测（dual-luciferase reporter assay）通常以萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)为报告基因，以海肾萤光素酶(renilla luciferase)为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势，广泛用于基因调控、非编码rna靶向互作等研究领域。
firefly luciferase（简称f-luc）以荧光素(luciferin)为底物，在mg2 、atp和氧分子存在条件下，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在此过程中发出最强波长在560nm左右的生物荧光(bioluminescence)。f-luc表达框的上游启动子区域插不同功能序列，可以通过转录起始条件造成其报告荧光的变化。在f-luc的3’utr区域插入待验证的靶序列，通过其翻译抑制或mrna稳定性降低，可以反映是否存在靶向互作。
renilla luciferase（简称r-luc）以腔肠素（coelenterazine）为底物，在氧分子存在的条件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，此过程中发出最强波长在465nm左右的生物荧光。r-luc通常由固定组成型启动子驱动，在报告系统中作为校正input误差的内参信号。
生物荧光产生反应式
一、应用方向
1. 验证microrna同mrna靶向互作。将待测mrna的3’utr序列插入报告基因载体，再共转入该microrna，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。
2. 验证microrna同lncrna靶向互作。将候选的lncrna序列插入报告基因载体中f-luc的3’utr区域，检测荧光素活性。
3. 启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。
4. 启动子snp分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。
5. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。
6. 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，荧光素酶活性代表了通路的下游响应。例如，在gpcr研究中，将camp response element（cre）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析gpcr的激活与抑制剂筛选。又如，将hif1α的响应原件hypoxia-responsive element (hre)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关通路的研究。
二、常用荧光素酶报告基因载体
pgl3-basic
prl-tk
pmirglo
三、经典案例
案例一题目：long non-coding rna linc00673 regulatednon-small cell lung cancer proliferation,migration, invasion and epithelialmesenchymal transition by spongingmir-150-5p
期刊：molecular cancer
小结：验证linc00673具有mir-150-5p的靶向结合位点。将linc00673包括预测结合位点的序列克隆到pmirglo- linc00673-wt，同时构建靶位点突变的pmirglo- linc00673-mut，分别共转mir-150-5p mimics及nc mimics，结果显示mir-150-5p转染组的相对荧光值降低，提示存在靶向结合。
图：rna与质粒共转染293t，24h后双荧光素酶检测
题目：sox9 indirectly regulates ceacam1 expression and immuneresistance in melanoma cells
期刊：oncotarget
小结：验证sox9对于ceacam1的转录调控作用。分别使用了两种黑色素瘤细胞526mel和624mel，对ceacam1的启动子区域分别选择了600bp-200bp的截短片段，共转染过表达sox9，显示sox9能够抑制ceacam1启动子的转录。
图：截短的pceacam1进行双荧光素酶检测
相关技术服务
下一篇：慢病毒使用操作方法
