技术专题
载体构建实验总结
文章来源：原创
作者：genecreate
发布时间：2017-12-14 16:31
以前考研的时候就开始接触各种载体，构建的质粒也有几十种了吧，周期长短的都有，到现在在8846威尼斯-威尼斯2299工作后，确实又积累了不少经验，想了想还是把经验写下来，一来做个记录，二来，或许能让大家少绕点弯路。
1. 前期工作
俗话说用欲善其事，必先利其器。我强烈建议大家在做构建之前先找好工具，这样起的效果事半功倍。这里推荐大家两个工具，一个都知道，primer5.0。另一个工具极强大，也不知道国内流行不，叫lasergene，也就是dnastar包括设计引物到构建图谱一应俱全，图谱非常漂亮，而且分析酶切位点等等就超nb，如果感兴趣的话我可以給大家传一个图谱看看。
2. pcr
如果没有现成的质粒可供酶切，pcr是最理想也是最方便的策略。关于pcr具体技术坛子内帖很多，我不多说了，这里仅在构建方面谈一谈。
如何设计引物？
首先，看懂质粒图谱！
拿大家比较熟悉的pegfp-c1和pegfp-n1做例子。想用n1质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白，你就死了；c1质粒，注意frame，要是移码了，你也死了。而且pegfp系列有1、2、3，要弄清楚别弄窜了。一句话，要看懂你的图谱！再多一句，pegfp的xba1和bcl1位点不能用。
注意在设计酶切位点的时候要加保护碱基（大家要用t载体就当我没说）。酶切位点设计也有一定的讲究，我的原则是，能用粘端就用粘端，实在不能用的就用只好用一些常用的平端酶，如ecorv和snab1之类，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，我曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算tm的时候要减去这些不match的序列， 或者选用touch-up策略。
除了酶切位点，还要注意kozak序列的问题，很多质粒没有提供kozak序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。
gene overlap也比较有用，比方说加个flag片段，his片段，2a序列之类的，直接设计三引物overlap一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。
引物长一点不要紧（我最喜欢两步法了），尤其是对gc比高的序列，有时候引物不长pcr根本不出结果，注意如果gc比较高，这个时候gene overlap就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。
没有合适的酶切位点？
很简单，用同尾酶策略，比方说bgl2和bamh1，nhe1和spe1，xho1和sal1（注意连上了切不下来），实在不行就平端吧，只要不超过4kb，平端酶连接也不那么难。
如何选择taq酶？
选择taq酶也很关键，首先，高保真（high fidelity）这是必须的，我在国内常用la kit，可这边***忑贵，只好用（美）国货。常用的pfu，phusion和pfx。pfx50是invitrogen公司的，一度曾卖到脱销，保真性应该是目前最高的，是普通taq的50倍，对一般基因绝无问题（我同事4.5k pcr产物，居然一个突变都没有），但是对比较难pcr的高gc或者位点比较难做pcr的基因（基因组为模板）就明显不行了；pfu(安捷伦)保真性没有pfx50高，但是能力很强，略贵点；phusion是neb公司的，不贵，但是这个酶很怪异，每次用都要把annealing温度调高好几度，否则就出杂带，个人觉得neb内切酶绝对是no.1，但是taq就不如invitrogen了，如果实验室有钱，直接买invitrogen的spuermix，什么都混好了，连ddh2o都搞定，只要直接向里加模版和引物就ok，每次我要拿漂亮的结果都用supermix。
还是那句话，读说明书。同是高保真taq酶，iproof 要求98度起始1min，pfx就要求95起始2min ，延伸有的是72，有的是68，有的要加1ul，有的加0.5，有的tm要低五度，有的高三度，这些必须要读说明书，读且仔细读，这是拿到任何试剂都要做的第一步。
如果基因太难pcr，怎么办？
首先，dmso是好物，好到甚至fisher的phusion就直接写上了dmso这项，注意3%-6%，太高taq酶活性就不行了。如果gc太高而且片段过长的话，dmso也不行，gc低的不推荐。
我做个过一个2.8k，gc比高达92%的基因pcr，一共做了两周，从保真性最强的pfx50到普通的promega 2xgo taq都试过，什么dmso，甘油，biorad的iproof with high gc buffer， neb one taq 2x taq high gc(还带enhancer的)，takara 的la都试过，都不行，要么不出带，要么就是乱七八糟的带一起来，头晕脑涨的我都打算抹平策略了，后来从别的实验室弄来一个clontech的2 gc rich kit，一次搞定！强烈推荐这个kit，太牛了，在别家都缴械的时候，它一锤定音，不过价格也比别家都牛，10次反应就130刀，其实实验室大可以备一个，就是防备超高gc又长的片段。不过这个kit非高保真，送了三个克隆测序，各在不同部位有突变，于是我就从a克隆切一段接到b克隆上，又从c克隆切一段接b克隆上。注意的问题是：gc比太高测序也很困难，正常gc能测1k左右，到了high gc就能测个五六百，这时要多准备些引物。
pcr产物的纯化
如果带很单一，又强，直接pcr产物纯化就可以，如果有杂带，但目的带也很强，跑胶，目的带切胶回收。回收这里也有个瓶颈，就是回收率的问题，我试过很多家的kit，promega的gel回收试剂盒效率和价格都很合适，推荐这个。
关于t载体，我在国内的时候是必用的，到了美帝反倒一次没用过，这边比较流行直接用pcr产物切，就是回收完了直接切上，回收后然后连接，这又回到了最开始设计，要加保护碱基。这个策略好处就是免除了t载体这步，直接插入目的载体，存在的问题就是处于盲做状态，还要加保护碱基。
3. 酶切
我的原则一向是：尽量避免pcr，能酶切的多酶切，实在没办法才去pcr。
这里强烈推荐neb的内切酶，还记得在有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了（当然当时质粒浓度也不高），而用neb的酶，切个七十二小时仍旧一切ok，尤其现在neb还推出了hf的内切酶，没有星活性而且统一都用buffer4，很好用，在国内我都用takara的酶，基本上还可以。
注意要读说明书，选用什么buffer，多少度，用不用加bsa，这些都要仔细读。
酶切的起始量，pcr产物没甚么可说的，全都切上，如果是从质粒上切片段，要根据你片段大小，片段适中，比如说7kb质粒，有2kb是目的片段，这时切个3-4ug就足够了，如果只有0.2kb，那最好多切点，6ug-7ug 内切酶也没问题。
4. 连接
最常用的是neb的t4和promega的t4，都很好用，但是注意buffer里有atp，反复冻融atp失活得很快，这时有两种办法，一种是象我们chair实验室，每次连接都统统朝里面加1ul atp；另一种是我们实验室的策略，拿到buffer就分装，10ul/管，一次性使用，哪怕就用1ul，剩下的直接扔掉。
连接最重要的注意事项，1，载体总量，2.载体和插入片段比例，3.载体和插入片段质量。
我在回收之后都要测载体浓度，一般来说，载体浓度在20-100ng/ul很好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，总量从50-100ng就可以，太低失败几率很高，太高克隆太多，挑克隆会很麻烦，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低，而且对感受态细胞也是个挑战，通用10-15ul，我试过25ul没有问题，40ul就不行了。
载体和插入片段比例一般是1:3，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高载体浓度，同时加大比例1:10，我试过一端平一端粘连接，4kb片段，4kb载体，连接成功率相当高，10个克隆里8个都是阳性的，但是7kb片段，5kb载体的平端连接就连试两周都失败，最后换策略分两段先后克隆进去的，这也給了我很深教训，隔了一阵又做类似的实验，这回我干脆连试都没试，继续分成两段分别连进去的。
3片段连接同理，如果片段不太大，比方说小于3k，3片段连接成功几率很高，但是如果你片段太大，就不行了，我试过4k载体，4k片段a，2k片段b连接，失败四五次，最后还是绕路走了。
5. 转化
这个简单，遵循基本的准则就行，话说实验室原来从sigma买感受态（competent cell），后来发现还是自己做的效率高，尤其在使用xl-10细菌时比dh5a效率要高，需要的话我可以发protocol上来。要注意的是lb必须无菌而且没有抗生素，实验室原来有个volunteer，做一次失败一次，我就奇怪了，后来才发现他用的居然是加了kana的lb，直接晕过去了。还有就是氯化钙的问题。氯化钙吸水性很强，吸水后就完蛋了，我一般把它放在干燥罐里（反正我也不知道啥名字，就那种玻璃罐，干燥用的），大家要不放心，用之前可以把氯化钙放在烘箱里烤一烤。
6. 酶切鉴定
普通实验做酶切鉴定，阳性率非常高，大多数情况下四个中起码有三个是正确的，很多时候都是百分百正确，这里推荐一种叫fast digest的酶，切个十几分钟跑胶就行了。
如果找不到合适的酶切位点或者有其他问题，比方说，有段时间我做个非常新潮的实验，初始步骤的虽然是蓝白筛选，但是白斑也大部分都不对，没办法鉴定就用菌液pcr，最夸张的一次是五十个白斑里面居然就一个阳性的（没办法，该实验特点），这要提质粒可提不起。菌液pcr也有讲究，很多人做菌液pcr鉴定假阳性特多，为甚么？因为你pcr引物选的都在载体上，注意，引物必须分别在载体和插入片段上才准，pcr方法鉴定是极其准确的，我做过数百次菌液pcr，只要pcr条件正确，pcr和酶切结果绝对百分之百对得上。pcr鉴定做起来也很简单，拿个2ml tube，装0.5ml 加入相应抗生素的lb，摇个三小时左后取1ul做模板就行了，楼下有个实验室的postdoc特喜欢做直接的菌落pcr，我没试过，效果怎样不好说。
还要多说一句，要注意质粒是低拷贝还是高拷贝，普通的质粒一般4ml摇过夜，1.5ml就能提到500ng/ul 总体积40ul的质粒（根据试剂盒不同，最高提过800ng/ul，也试过200ng/ul，都正常）。如果是低拷贝质粒，象pet系列和pshuttle系列，都是低拷贝，能拿到100ng/ul就已经很好了，这时候需要4ml菌当2ml提，但是最要命的还是adeasy 质粒（用来做腺病毒的），这个质粒超过30kb，普通kit回收效率低到忍无可忍，一定要用特定的试剂盒才行，还是那句话，这些都要读说明书。
7. 测序
我们拿到测序结果时候，不仅要核对具体的序列，而且要看测序图，这很重要，因为有时候光看结果对，实际上图显示的不对，或者虽然结果不对，但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信，出现突变也不怕，有很大可能性是简并密码子，还要重点检查的地方就是“接头”的地方，因为偶尔引物会出错，比方说少个碱基什么的，还有时候酶切之后连接也会丢一或者俩碱基什么的（这些问题我都碰到过），如果不仔细检查到了后期悔之无及。
还要注意反向测序引物，尤其用到sv40，因为我用pegfp这套质粒用习惯了，等换成大概是tet-on那套系统，sv40正好是反过来的，我也没留神，结果测回来的是载体……又吃了一次教训。
最后，希望我的一些个人体会能尽绵薄之力！
