在外泌体当中，含有大量疾病相关的多种rna分子，如mirna，mrna，lncrna等，而外泌体中rna含量的高低主要是通过荧光定量pcr来鉴定。但是如果出现检测内参不齐，就会限制rna分子定量检测的标准，而引入外参在外泌体rna定量分析中是另外一种可选的有效手段。外参法主要是在检测过程中，加入到待检测样本中的外源性物质，加入的外源性物质可以很精确的反映不同样本在检测过程中出现的偏差。所以若是出现内参不齐时，可以考虑引入外参。
elisa可以用来检测样本中特定蛋白或细胞因子含量，同样也是可以用来检测外泌体中一些标志性蛋白。elisa试剂盒检测的样本是有多种类型的，如血清、血浆、尿液、细胞培养上清或组织匀浆液等，对于不同的样本，前期的处理方式也是不同的， 对于elisa实验的来说，实验样本的处理非常关键。在处理过程中，使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测成分。在净化过程中加入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去除全部有机溶剂。同时要对尽量去除待测样本中的杂质，以防干扰实验结果。
正常情况下，血清中外泌体的含量还是很高的。一般常规实验血清纯化外泌体，建议可以先对外泌体进行鉴定，通过电镜检测观察一下外泌体的是否具有杯状结构，然后通过nta检测一下粒径大小和粒径浓度，确定没问题进行再进行wb验证。 wb实验失败的一些原因：（1）抗体染色不充分，可以增加抗体浓度，延长孵育时间进行改善。（2）检查酶是否失活，可以直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。（3）可以增加阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有，则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可以增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。（4）检查抗体是否失效，看抗体是否过期，工作液尽量现配现用。
目前外泌体蛋白提取的方法相对较少，有的可以通过购买试剂盒来购买提取外泌体蛋白。在一篇专利中提到如何提取血清中的外泌体，专利申请号：cn201810287204.6 专利名称：提取外泌体及外泌体蛋白的方法 提取外泌体方法步骤：所得含有外泌体的材料(即洗涤后的沉淀)置于冰上，向其中加入18μl4g/100ml的sds水溶液，然后超声(超声条件在100w下进行)裂解20分钟，得到超声产物；将超声产物在16000g下离心5分钟，收集全部上清液；向上清液中加入82μl 8m尿素水溶液和二硫苏糖醇，得到裂解液，该裂解液中二硫苏糖醇的浓度为20mmol/l；将该裂解液在37℃孵育4小时，得到裂解产物；将裂解产物转移至fasp管中，用8m尿素水溶液洗涤(fasp管是一种按分子量截留的管，洗涤过程都是通过离心完成，离心条件为14000g离心10分钟，离心以后，绝大部分溶液和小分子物质被离心至下层接收管子里，外泌体被截留在上层的fasp管中)2次；然后加入碘乙酰胺(终浓度50mmol/l)，室温下避光反应1小时，用50mm碳酸氢铵水溶液洗涤3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小时，将所得溶液45℃热干，用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容，得到外泌体蛋白提取液，将外泌体蛋白提取液上样进行lc-ms/ms分析，上样量为1μg。所得含有外泌体的材料(即洗涤后的沉淀)置于冰上，向其中加入18μl4g/100ml的sds水溶液，然后超声(超声条件在100w下进行)裂解20分钟，得到超声产物；将超声产物在16000g下离心5分钟，收集全部上清液；向上清液中加入82μl 8m尿素水溶液和二硫苏糖醇，得到裂解液，该裂解液中二硫苏糖醇的浓度为20mmol/l；将该裂解液在37℃孵育4小时，得到裂解产物；将裂解产物转移至fasp管中，用8m尿素水溶液洗涤(fasp管是一种按分子量截留的管，洗涤过程都是通过离心完成，离心条件为14000g离心10分钟，离心以后，绝大部分溶液和小分子物质被离心至下层接收管子里，外泌体被截留在上层的fasp管中)2次；然后加入碘乙酰胺(终浓度50mmol/l)，室温下避光反应1小时，用50mm碳酸氢铵水溶液洗涤3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小时，将所得溶液45℃热干，用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容，得到外泌体蛋白提取液，将外泌体蛋白提取液上样进行lc-ms/ms分析，上样量为1μg。
超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。本实验室通过超速离心法提取植物外泌体，有的外泌体粒径大小在200nm左右，提取的浓度在正常范围内。一般在样本前处理步骤最后一步经0.22微米滤膜过滤，除去较大的囊泡，再进行超离即可。或者可以选用试剂盒或者尺寸排阻方法提取外泌体。
1. 超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，也是普遍认可的一种方式，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。 优点：无需特殊试剂，操作简便，适合大批量样本。 缺点：耗时耗力，纯度相对较低，回收率不稳定，重复离心会一定程度损伤外泌体，设备要求高。 2. 抗体亲和（磁珠）法利用包被单克隆抗体的磁珠结合外泌体，外泌体表面有其特异性标记物（如cd63、cd9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。 优点：纯度较高，特异性和重复性好、操作简便、无设备限制。 缺点：效率和回收率较低，仅能捕获表达特定抗原的目标外泌体，外泌体生物活性易受ph和盐浓度影响，囊泡完整性影响较大。 3. 微流控指的是使用微管道（尺寸为数微米到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为纳升到阿升）的系统所涉及的科学和技术。这种方法具有分离生物颗粒速度快，纯度高，节省样本，集成度高等优点。因此，虽然微流控技术在外泌体分离方面的应用仍处于起步阶段，却已经成为了当前研究的热点。目前，近些年，基于微流控的外泌体分离技术也在不断出现。 4. 尺寸排阻色谱(sec)是基于尺寸而非分子量分离大分子，尺寸排阻色谱可以精确地分离大分子和小分子。sec主要用于分离血液和尿液中的外泌体，不过，这种外泌体提取方法需要很长时间，并且不适合处理大量样品。
外泌体鉴定可以通过电镜、粒径以及wb来进行，生物标志物可以选择cd63、cd9、cd81 以及tsg101、hsp70、alix，一般通过wb的方式验证外泌体是否含有一些标志性蛋白。
推荐使用华美公司的外泌体提取试剂盒来提取尿液中的外泌体，它能快速提取高质量高纯度的外泌体。目前主流的提取外泌体的方法都各有利弊：使用尺寸排阻色谱(sec)是基于尺寸而非分子量分离大分子，尺寸排阻色谱可以精确地分离大分子和小分子。sec主要用于分离血液和尿液中的外泌体，不过，这种外泌体提取方法需要很长时间，并且不适合处理大量样品。使用超速离心可以一次性获得较多外泌体，但是纯度不足；密度梯度离心法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂、耗时、量少； 抗体亲和（磁珠）法：纯度较高，特异性和重复性好、操作简便、无设备限制。缺点：效率和回收率较低，仅能捕获表达特定抗原的目标外泌体，外泌体生物活性易受ph和盐浓度影响，囊泡完整性影响较大。
细胞培养液的量建议选择在合适的范围，但是目前尚未发现，培养液的量过多会影响外泌体的浓度。
外泌体装在分为两种：一个是内源装载：细胞可以产生外泌体，根据外泌体产生的过程，对细胞进行适当改造，让其产生携带目标分子的外泌体。 另外一种方法是外源装载：操作简单，稳定性更高，更适合放大化生产。目前，外源装载的常用方法有孵育、电穿孔、超声、反复冻融等。 孵育法操作简单，不会破坏外泌体膜的完整性，适用于装载疏水性小分子。电穿孔主要适用于装载亲水分子，装载效率较高。但是可能破坏外泌体膜的稳定性。超声法是利用探针超声仪对外泌体进行超声处理，使外泌体膜变形，产生瞬态小孔，增加膜的通透性，从而允许小分子物质扩散到外泌体中。装载效率高于电穿孔和孵育，但是对外泌体膜的损伤较大，可能导致外泌体破裂。
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