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q:对于胶条鉴定,客户更多关注的是样品中蛋白的氨基酸序列,如果数据库中没有该蛋白的氨基酸序列,有没有其它方法来获取蛋白的氨基酸序列?

目前是基于数据库比对结果给出鉴定蛋白的序列信息。如果选择的数据库里没有该蛋白的氨基酸序列,则该蛋白不会被鉴定到。基于从头测序方法(de novo),能够给出一些新肽段的序列信息,但要拼接出该蛋白的全长序列有一定难度。

q:胶条鉴定的结果中有很多蛋白,怎么确定这些蛋白的含量高低?

胶条鉴定是一种定性分析,不是定量分析。如需要知道蛋白在一个样品中含量高低,可以根据每个蛋白的谱图数量进行粗略估计,谱图数越多,说明该蛋白丰度越高。如要对多个样品的同一个蛋白的含量进行比较,则可选择itraq或者label free法进行相对定量。

q:胶条鉴定结果中,如何挑选可信蛋白?

在胶条鉴定中,鉴定蛋白的标准是至少含有一个unique peptide,列表中都是鉴定到的蛋白,并给出相应的得分。老师可根据得分,结合分子量、等电点等信息筛选目标蛋白。

q:胶点鉴定结果与跑出的双向蛋白图谱比较,发现有些蛋白质得分最高的点分子量或等电点与图谱上不对应,相差较大,请问在这种情况下,该如何判断一个胶点中给出的几个甚至十几个点蛋白中哪个蛋白可信度最高?

蛋白质谱鉴定是通过肽段归并到蛋白,因此有些鉴定到的蛋白可能是目标蛋白的同源蛋白或该蛋白的一亚基,而蛋白的人为或天然修饰、降解等情况都会影响该蛋白出现在胶图中的位置。 一般来讲,mascot鉴定得分越高,可信度就越高,其次可以结合分子量、等电点、肽段覆盖率等信息筛选可信度高的蛋白质。

q:如何保证蛋白的鉴定质量?具体设置什么标准?

为了保证蛋白的鉴定质量,我们是有一套过滤标准的:   首先,对于肽段和谱图匹配的离子得分(ion score),mascot会给出一个鉴定阈值(identity score),如果离子得分(ion score)大于鉴定阈值(identity score),则为可信的肽段匹配;低于阈值的肽段匹配,是不可信的,会被过滤掉。对于不同的离子得分,mascot会根据候选肽段段的数目和得分来确定这个阈值,所以这个阈值并不是固定的某个值。   为了保证蛋白的可信程度,还可以设置蛋白的特有肽段的个数(unique peptides),即唯一对应某个蛋白的肽段。只有当蛋白含有至少1个unique peptide就认为被鉴定到,同时会给出得分。

q:血浆蛋白itraq能鉴定的蛋白数量?

500-1000,不同物种会有差异。

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