dna pulldown|dna试剂盒|dna杂交|dna测序服务 -8846威尼斯
- dna-蛋白质相互作用
- 基因调控
- dna修复
- 染色质结构和功能
服务特色
dna pull-down技术是研究dna-蛋白质相互作用和调控的有力工具，有助于揭示基因调控网络、信号传导途径和疾病机制等方面的重要信息。
服务介绍
dna pull down是用于分析蛋白质与dna互作的一种分析技术。一般来说，该实验首先需要针对待研究目的基因的调控区域设计并制备特异性探针（以脱硫生物素标记为主流）；同时，制备细胞核提取物；将探针和核提取物共同孵育，dna结合蛋白就会和靶向序列特异性结合；然后，通过亲和素磁珠纯化蛋白质dna复合物；最后针对获得的蛋白，使用wb验证或者质谱方式鉴定蛋白质类型。
服务优势
- 高特异性：能够高度特异地富集与目标dna序列相互作用的蛋白质，具有较低的背景干扰
- 可定量分析：可对dna-蛋白质相互作用进行定量分析，如荧光或放射性标记的探针，可测量结合的强度和亲和力
- 适用于高通量分析：dna pull-down技术可进行高通量分析，同时研究多个dna-蛋白质相互作用，提供更全面的信息和更深入的洞察
- 低样本量要求：仅需要少量的样本即可进行实验，对于限量样本或珍贵样本的研究具有重要意义
- 适用范围广泛：可在不同实验条件下应用，包括体外和体内研究，适用于各种生物体系和细胞类型。它可以用于研究不同生物过程中的dna-蛋白质相互作用，例如基因调控、dna修复、染色质结构和功能等。无论是研究基础生物学还是疾病机制，dna pull-down技术都具有广泛的适用性
服务流程
客户提供
dna序列相关信息或dna过表达质粒
细胞样品
如wb检测则需提供特定蛋白一抗
送样要求：
1、质粒至少提供10ug
2、冻存细胞两只或复苏细胞两瓶
3、动物或植物组织至少500mg
4、细胞沉淀至少2*10的7次方
注：除了复苏细胞常温运输以外，其他样品均干冰运输。
最终交付
- 构建含目的基因的质粒、菌液，测序报告
- dna pull-down蛋白sds-page银染图
- wb检测报告/质谱鉴定分析报告
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期(工作日) |
| dna pull-down | 探针扩增回收 | 扩增2次 | 16 |
| 蛋白提取 考染 | 1个样本 | ||
| pull down实验 | 富集2次：igg、ip各1次 | ||
| sds-page银染 | 跑胶3个泳道：igg、ip、input | 4 | |
| 质谱鉴定互作蛋白 | 质谱鉴定：igg、ip | 10-15 |
案例展示
常见问题与解析 (q&a)
emsa是用特定序列的标记探针，同待验证蛋白孵育后进行native-page凝胶电泳，如果存在同探针结合的蛋白，则会出现电泳迁移率明显低于自由探针的条带出现。 dna pull-down是将探针结合在凝胶/磁珠上，以此收集同该dna探针发生互作的蛋白。chip实验中所检测的dna-蛋白互作则发生在活组织细胞内。
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1、dna pull-down技术的实验步骤
● dna探针的制备：首先，需要合成或制备与目标dna序列相互作用的探针。探针可以是特定序列的寡核苷酸或dna片段，可以通过化学合成或pcr扩增等方法获得。
● dna探针的修饰：为了方便实验操作和检测，dna探针可以进行修饰，如在末端引入标记物（如生物素或荧光染料）。
● 蛋白质提取：提取目标蛋白质样品，可以是细胞裂解物、组织提取物或纯化的蛋白质。
● dna探针的固定：将修饰的dna探针固定在固相载体上，常用的载体有琼脂糖珠或磁珠。dna探针与载体的结合可以通过生物素-亲和素、亚硫酸酯化学反应等方法实现。
● dna-蛋白质结合：将蛋白质样品与固定的dna探针一起孵育，使其发生特异性结合。在孵育过程中，可以添加适当的缓冲液和辅助物质来维持适宜的条件。
● 洗涤步骤：通过多次洗涤的步骤，去除非特异性结合的蛋白质，以增加实验的特异性和准确性。洗涤条件可以根据实验需求进行优化。
● 蛋白质的检测和分析：通过各种方法，如western blot、质谱分析、荧光检测等，对结合到dna探针的蛋白质进行检测和分析。可以使用特异性的抗体来检测目标蛋白质的存在和结合情况。
● 结果解读：根据实验结果，解读蛋白质与dna之间的相互作用情况，并进一步分析其功能和调控机制。
2、dna pull-down技术的应用
● 基因调控研究：dna pull-down技术可用于研究转录因子与基因启动子的结合，揭示基因调控机制和转录调控网络。这对于理解基因表达调控、发育过程和疾病发展等具有重要意义。
● 信号传导途径研究：dna pull-down技术可以用于研究信号传导途径中的关键蛋白质与dna的相互作用，如激活因子、抑制因子等，有助于阐明信号传导机制和调控网络。
● 疾病机制研究：dna pull-down技术可用于研究与疾病相关的基因突变位点或调控元件的结合蛋白，帮助揭示疾病的发生和发展机制，为疾病的诊断和治疗提供理论依据。
● 药物开发与筛选：dna pull-down技术可以用于筛选与特定dna序列结合的小分子化合物或药物，帮助寻找新的药物靶点和开发潜在的药物治疗方法。
● 比较基因组学研究：dna pull-down技术可用于比较不同物种、不同组织或不同条件下的dna-蛋白质相互作用，帮助理解基因组的进化、组织特异性和环境适应等方面的变化。
3、dna pull-down实验结果不如预期如何优化
● 问题1：非特异性结合：蛋白质可能与非特定的dna序列结合，导致背景信号增加。
优化建议：尝试优化dna探针的设计，选择更特异的dna序列作为探针，以增加结合的特异性。还可以通过引入竞争性dna或非特异性dna序列来减少非特异性结合。
● 问题2：低信号强度：信号强度较弱，难以检测目标蛋白质的结合。
优化建议：优化孵育条件，包括孵育时间、温度和缓冲液的组成。调整孵育时间可能需要更长的孵育时间，以增加结合的效率。调整温度可以根据蛋白质的最佳结合温度进行优化。此外，优化缓冲液的组成，如添加剂或酶抑制剂，可以提高信号强度。
● 问题3：浓度依赖性：蛋白质的结合可能与其浓度相关，导致信号的变化不确定。
优化建议：尝试不同浓度的蛋白质进行实验，确定最佳的浓度范围，以获得最强的信号。此外，可以使用标准品或内部对照来定量分析，以校正信号的变化。
● 问题4：样本纯度不高：样本中可能存在杂质或其他干扰物质，影响目标蛋白质的结合。
优化建议：优化样品处理步骤，如使用高纯度的核酸提取方法，减少杂质的存在。此外，可以使用特异性抗体进行预处理，以去除非特定结合的蛋白质。
