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外泌体蛋白质组经典文章—ubl3影响蛋白质向小型胞外囊泡转化
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-12-05 15:42
题目：ubl3 modification influences protein sorting to small extracellular vesicles
期刊：nature communications
影响因子：12.353
研究背景
外泌体是一种小型胞外囊泡（sevs），来自于多泡体（mvbs），通过运输蛋白质、mrna和mirna介导细胞间的通信。然而，哪类蛋白质被归为sevs的分子机制还不是完全清楚。在这里，作者报道了泛素样3（ubl3）膜锚定的ub折叠蛋白mub作为翻译后修饰因子ptm调节蛋白向胞外囊泡转化。作者发现ubl3的修饰对于将ubl3归类到mvbs是不可缺少的。同时作者还发现从ubl3缺失型小鼠样本中纯化的sevs总蛋白，与野生型小鼠相比减少60%，并从蛋白质组学分析结果中发现了1241个与ubl3互作蛋白，包括ras。作者展示了ubl3改变ras基因和致癌基因rasg12v突变体，ubl3的表达促进rasg12v到sevs的转变。综上所述，结果表明ptm被ubl3取代并影响蛋白到sevs的归类转化。
研究内容及结果
1. ubl3作为转录后调控因子的分析
目前对于ubl3作为ptm转录后调节因子的作用还不清楚，为了明确这一调控机制，作者在mda-mb-231乳腺癌细胞中过表达带flag的flag-ubl3（16kda），并通过免疫共沉淀纯化ubl3蛋白。有趣的是，在过表达flag-ubl3细胞中，ubl3条带出现弥散现象，并在样品装入sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳之前添加2-mercaptoethano（βme+）后信号消失。为了验证ubl3修饰确实发生在体内，作者建立了ubl3敲除小鼠，并在脑组织（此组织ubl3高表达）中分析ptm，发现ptm表达下降。作者同时构建了ubl3c113/114突变，检测发现不仅在mda-mb-231细胞中，在每一个所检测的细胞中ubl3均不表达。但在ubl3c113a和ubl3c114a突变体中，ubl3修饰表达虽降低但仍能检测到其表达。
图1 ubl3作为转录后修饰因子的分析
2. ubl3向mvbs和sevs转化过程中ubl3的修饰不可缺少
作者通过免疫荧光检测ubl3的亚细胞定位，发现细胞质中ubl3修饰程度下降。接着构建ubl3加egfp荧光，并与mvbs的标记物cd63进行融合分析，进一步验证ubl3在mvbs多泡体中富集。为进一步证明mvbs多泡体中ubl3修饰与定位，作者检测了ubl3c113a、ubl3c114a、ubl3c113/114a及ubl3△1与cd63融合分析，与野生型ubl3检测不同，野生型的未见到与cd63融合。为了了解ubl3在多泡体及膜中的定位，作者又进一步安排了免疫电镜检测。将加了flag标签的ubl3质粒转染进mda-mb-231细胞后，ubl3在mvbs及质膜中表达清晰，在线粒体及核膜中未检测到表达。其中ubl3△1主要定位于质膜，不在mvbs中。这些结果显示ubl3修饰在mvbs形成中是必须的。
图2 ubl3向mvbs转化依赖ubl3修饰共定位检测
图3 亚细胞定位及ubls到外泌体的归类
3. ubl3敲除小鼠中外泌体中总蛋白下降，ubl3修饰影响蛋白向胞外分泌
作者在前期的研究中发现，mvbs更多的倾向于分泌成胞外囊泡evs，将mda-mb-231细胞分泌上清分别在2000×g（2k）离心力、10000×g（10k）离心力及100000×g（100k）离心力下离心，发现在100k离心力下ubl3富集程度最高。通过对构建的ubl3敲除小鼠与正常小鼠进行蛋白质组学定量分析，发现ubl3敲除小鼠中外泌体总蛋白含量比野生型降低60%。
图4 ubl3敲除小鼠中外泌体总蛋白量鉴定
为更好的了解ubl3修饰后其生理功能，作者进行了全面的蛋白质组学研究分析，ubl3互作蛋白依赖于两个c端半胱氨酸残基的方式。同时作者发现在与ubl3互作的蛋白中至少有22个与疾病相关的分子，包括与肿瘤形成、代谢、转移等相关，例如hras、kras、tgfbr1、tgfbr2、rb1、itga6、itgb4、mtor、tsc2及aplp2。同时发现与免疫应答相关的分子mtor、rptor及tsc2，notch信号分子notch1、notch2、notch3等。为检测ubl3是否经外泌体形式引起受体细胞中ras信号激活，作者将从经rasg12v转染的mda-mb-231细胞上清中提取的经pkh67包被的外泌体与细胞共孵育，检测磷酸化erk的表达情况，结果发现，相比于从ubl3c113/114a及rasg12v共转染后提取外泌体孵育组，磷酸化的erk（perk）在经野生型ubl3及rasg12v共转染后外泌体孵育组perk表达明显上调。ubl3修饰诱导了rasg12v到外泌体sevs转化过程中ras信号的激活，ubl3作为一个类似于标签的作用向sevs传递蛋白。
图5 ubl3修饰影响蛋白到胞外分泌检测
文章小结
1.通过研究数据表明ubl3通过c端半胱氨酸残基二硫键结合靶蛋白，尽管ubl3有泛激素类似的区域，但ubl3修饰与传统泛激素作用不同。
2. 作者证明了ubl3修饰在ubl3向mvbs及sevs转化过程中起重要作用。检测到1241个与ubl3c端半胱氨酸残基互作蛋白，其中29%被注释为胞外泌体，同时发现ubl3敲除小鼠中外泌体蛋白总量降低60%，显示ubl3极大可能参与过半的外泌体蛋白归类过程。ubl3与特定蛋白的结合是短暂的，只有ubl3修饰后蛋白在细胞裂解过程中稳定存在。
3. 外泌体sevs中的特异性蛋白在肿瘤的生长发生及转移过程中其中重要的作用。本文中作者通过蛋白质组学确定了1241个依赖于两个c端半胱氨酸残基结合与ubl3互作的蛋白，其中包括了至少22个疾病相关分子，影响perk磷酸化蛋白的表达。因此，抑制ubl3修饰可能成为与sev相关疾病的治疗靶点，具有潜在的影响。
解析文献
hiroshi ageta, natsumi ageta-ishihara et al. ubl3 modification influences protein sorting to small extracellular vesicles. nature communications, 2018, doi: 10.1038/s41467-018-06197-y
参考文献
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外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。同时，外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。
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