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western-blot（wb）实验经验总结
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-11-13 13:29
我做了很久的wb，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~
如果单独做wb的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。
另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于wb的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ecl法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。这就要求在做wb之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。
还有一个就是显影液的选择。如果选择了不合适的显影液，就会造成背景高，灵敏度差，易淬灭，发光时间短等问题。建议选择合适的显影液。我用的是enlight-plus这一款ecl发光液，超灵敏的，发光时间也挺长，最后出来的图像很清晰。
最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。