技术专题
蛋白质表达、分离、纯化步骤详解
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-08-13 17:16
金开瑞蛋白表达平台拥有原核、真核、无细胞等六大重组蛋白表达系统，已成功为客户研发出3000余种重组蛋白产品，涵盖细胞因子、激素、酶、病毒抗原和人类疾病相关蛋白等类别。平台拥有50-500l 大规模发酵平台、1m2冻干机、1500bar高压均质机等，可进行10g级重组蛋白制备。改造的表达载体和优化的实验流程，可在最短时间获得最高的产量。
蛋白质表达、分离、纯化可以：
（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；
（2）供作结构与功能的研究；
（3）作为催化剂、营养剂等。
实验步骤
一：材料准备
1. 实验材料：大肠杆菌 bl21、lb 液体培养基、氨苄青霉素、washing buffer、elution buffer、iptg、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠
2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒
二：实验操作
1. 试剂准备
2. 获得目的基因
① pcr 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），pcr 循环获得所需基因片段。
② 通过 rt-pcr 方法：用 trizol 法从细胞或组织中提取总 rna，以 mrna 为模板，逆转录形成 cdna 第一链，以逆转录产物为模板进行 pcr 循环获得产物。
3. 构建重组表达载体
① 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收 kit 或冻融法回收载体大片段。
② pcr 产物双酶切后回收，在 t4dna 连接酶作用下连接入载体。
4. 获得含重组表达质粒的表达菌种
① 将连接产物转化大肠杆菌 dh5α，根据重组载体的标志（抗 amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
② 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确， 进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
③ 以此重组质粒 dna 转化表达宿主菌的感受态细胞。
5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导
① 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌 bl21 菌株于 5 ml lb 液体培养基中（含 100 ug/ml 氨苄青霉素），37 ℃ 震荡培养过夜。
② 按 1∶50 或 1：100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 ml 过夜培养物于 100 ml（含 100 ug/ml 氨苄青霉素）lb 液体培养基中，37℃ 震荡培养至 od600 = 0.6 - 0.8（最好 0.6，大约需 3 h）。取 10 ul 样品用于 sds-page 分析。
③ 对照组不加诱导剂，实验组加入 iptg 至终浓度 0.5 mmol/l，37℃ 继续培养 1-3 h。
④ 12 000 rpm 离心 10 min，弃上清，菌体沉淀保存于 -20 ℃ 或 -70 ℃ 冰箱中。
6. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化
① nta 层析柱的准备：在层析柱中加入 1 ml nta 介质，并分别用 8 ml 去离子水，8 ml 上样缓冲液洗涤。
② 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入 5 ml 上样缓冲液， 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品 60 min，4℃ 12000 rpm 离心 30 min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取 10 ul 上清样品用于 sds-page 分析。
③ 上清样品以 10-15 ml/h 流速上 ni2+-nta 柱，收集流出液，取 10 ul 样品用于 sds-page 分析。
④ 洗脱杂蛋白：用 washing buffer 以 10-15 ml/h 流速洗柱，直至 od280 = 0.01 分步收集洗脱液，约 3-4 h，取 10 ul 洗脱开始时的样品用于 sds-page 分析。
⑤ 洗脱目标蛋白：用 elution buffer 洗柱，收集每 1 ml 级分，分别取 10 ul 样品用于 sds-page 分析。