技术专题
引物修饰的常见类型及应用
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-06-22 11:16
脱氧次黄嘌呤（deoxyinosine，di）：
脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基， 虽然不是真正意义上的通用碱基但当与其它碱基结合时会比其它碱基错配相对更稳定。 脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为di:dc > di:da > di:dg > di:dt. 在dna聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤首选与dc结合。
脱氧脲嘧啶 （deoxyuridine，du）：
脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。 每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7 ℃。
硫代（phosphorothioate，s-oligos）：
s-oligos是寡核苷酸中单核苷酸间的磷酸二酯键中的一个氧被硫代替后形成的，碱基被添加上后，再进行连接修饰。两个碱基之间的磷酸可以转换成双键"s"(用硫代试剂）代替普通的双键"o"（用碘溶液）。
硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。 您可以选择全硫代，但随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的tm值会降低，为了降低这种这种影响， 可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰，通常可以选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰。
磷酸化（phosphorylation）：
5'磷酸化是通过b-氰乙基化学反应添加到引物5'端的糖环上，而不是最后一个碱基上。可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应；在可抗外切酶消化的相关实验中，也用于阻止dna聚合酶催化的dna链延伸反应。
内部氨基修饰：
主要用c6-dt aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接（如碱性磷酸酶）。
：
5'aminolinker(c6)是在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过b-氰乙基化学反应添加到引物5'糖环上的，而不是添加到最后一个碱基上。5' c6氨基修饰可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在dna芯片（dna microarray）和多重标记诊断系统，目前主要用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物。
3'氨基修饰：
目前提供3'c7氨基修饰，它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32p或荧光素标记的同时3'可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，3'修饰可以抑制3'外切酶酶解，从而可用于反义实验。
巯基（thiol）：
5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。 例如可在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下制作巯基连接的荧光探针。 5'巯基修饰主要用5'巯基修饰单体（5'-thiol-modifier c6-ce phosphoramidite 或thiol-modifier c6 s-s ce phosphoramidite）， 用5'-thiol-modifier c6-ce单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基（trityl），而thiol-modifier c6 s-s ce单体修饰后须用dtt将二硫键还原成巯基。
生物素（biotin）：
生物素修饰的寡核苷酸能紧紧地结合在链霉亲和素蛋白上，链霉亲和素蛋白可以标记上荧光染料和酶或作为附着的中间结合物附着在固体物生物表面，不同的分子生物学和纯化方法都包含生物素修饰。生物素修饰可以利用c6或是teg间臂被添加在寡核苷酸的5’或末端，生物素teg需要纯化，中间的生物素修饰可以通过dt碱基加入，这种形式需要更多的纯化步骤。引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的dna/rna序列、离子通道构象变化等。
地高辛 （digoxigenin）：
地高辛是一种从毛地黄植物分离出来的类固醇物质，因为毛地黄植物的花和叶子是这种物质唯一自然来源，所以抗地高辛抗体不会结合到其他生物物质。地高辛经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的c5位置。杂交的地高辛探针可以由抗地高辛抗体来检测，这个抗体一般会与碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素或胶体金偶连。或没有偶连的抗地高辛抗体但偶连的抗体。地高辛标记的探针可用于各种杂交反应，如dna-dna杂交（southern blotting）、dna-rna杂交（northern blotting）、斑点杂交（dot blotting ）、克隆杂交、原位杂交及酶联免疫分析（elisa）。
间臂（spacer）：
spacer可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于dna发夹结构和双链结构研究。 c3 spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。 3'-spacer c3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。 spacer 18常用于引进一个强疏水基团。
附：常见荧光染料参数
脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基， 虽然不是真正意义上的通用碱基但当与其它碱基结合时会比其它碱基错配相对更稳定。 脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为di:dc > di:da > di:dg > di:dt. 在dna聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤首选与dc结合。
脱氧脲嘧啶 （deoxyuridine，du）：
脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双链的稳定性。 每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链熔点温度1.7 ℃。
硫代（phosphorothioate，s-oligos）：
s-oligos是寡核苷酸中单核苷酸间的磷酸二酯键中的一个氧被硫代替后形成的，碱基被添加上后，再进行连接修饰。两个碱基之间的磷酸可以转换成双键"s"(用硫代试剂）代替普通的双键"o"（用碘溶液）。
硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。 您可以选择全硫代，但随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的tm值会降低，为了降低这种这种影响， 可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰，通常可以选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰。
磷酸化（phosphorylation）：
5'磷酸化是通过b-氰乙基化学反应添加到引物5'端的糖环上，而不是最后一个碱基上。可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应；在可抗外切酶消化的相关实验中，也用于阻止dna聚合酶催化的dna链延伸反应。
内部氨基修饰：
主要用c6-dt aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接（如碱性磷酸酶）。
：
5'aminolinker(c6)是在合成循环的最后一步以亚磷酸胺的形式通过b-氰乙基化学反应添加到引物5'糖环上的，而不是添加到最后一个碱基上。5' c6氨基修饰可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在dna芯片（dna microarray）和多重标记诊断系统，目前主要用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物。
3'氨基修饰：
目前提供3'c7氨基修饰，它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32p或荧光素标记的同时3'可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，3'修饰可以抑制3'外切酶酶解，从而可用于反义实验。
巯基（thiol）：
5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。 例如可在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下制作巯基连接的荧光探针。 5'巯基修饰主要用5'巯基修饰单体（5'-thiol-modifier c6-ce phosphoramidite 或thiol-modifier c6 s-s ce phosphoramidite）， 用5'-thiol-modifier c6-ce单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基（trityl），而thiol-modifier c6 s-s ce单体修饰后须用dtt将二硫键还原成巯基。
生物素（biotin）：
生物素修饰的寡核苷酸能紧紧地结合在链霉亲和素蛋白上，链霉亲和素蛋白可以标记上荧光染料和酶或作为附着的中间结合物附着在固体物生物表面，不同的分子生物学和纯化方法都包含生物素修饰。生物素修饰可以利用c6或是teg间臂被添加在寡核苷酸的5’或末端，生物素teg需要纯化，中间的生物素修饰可以通过dt碱基加入，这种形式需要更多的纯化步骤。引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的dna/rna序列、离子通道构象变化等。
地高辛 （digoxigenin）：
地高辛是一种从毛地黄植物分离出来的类固醇物质，因为毛地黄植物的花和叶子是这种物质唯一自然来源，所以抗地高辛抗体不会结合到其他生物物质。地高辛经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的c5位置。杂交的地高辛探针可以由抗地高辛抗体来检测，这个抗体一般会与碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素或胶体金偶连。或没有偶连的抗地高辛抗体但偶连的抗体。地高辛标记的探针可用于各种杂交反应，如dna-dna杂交（southern blotting）、dna-rna杂交（northern blotting）、斑点杂交（dot blotting ）、克隆杂交、原位杂交及酶联免疫分析（elisa）。
间臂（spacer）：
spacer可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于dna发夹结构和双链结构研究。 c3 spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。 3'-spacer c3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。 spacer 18常用于引进一个强疏水基团。
附：常见荧光染料参数