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dna测序基本原理及流程
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2018-05-21 09:38
1977年，sanger等人发展建立起来的一种dna测序方法。
基本原理：
1.双脱氧链末端终止法
双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂—类似于正常dntp的2’,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddntp)，将延伸的dna链特异性地终止。其反应体系也包括单链模板、引物、4种dntp和dna聚合酶。共分四组，每组按一定比例加入一种 (ddntp)，它能随机渗入合成的dna链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸，可以从放射自显影带上直接阅读dna的核苷酸序列。
双脱氧链末端终止法测序基本原理示意
双脱氧链末端终止法特点
双脱氧链末端终止法不仅具有化学测序法的优点，而且更适用于大规模的测序。但它要求有一个纯净的单链dna模板和一个合成反应所需的特异性的引物。因此，早期的工作仅局限于单链噬菌体为模板，若干个不同的特定限制性内切酶酶解片段为引物，在模板链的不同部位引导合成，从而确定出噬菌体dna的核酸序列。然而，对于大量存在着的天然双链dna分子，因没有良好的制备产量和质量高的分离链的技术，而限制了双脱氧链末端终止法的应用程度。
经典的双脱氧链末端终止法测序技术的改进
标记物方面的改进： 由于放射性同位素对人体的危害，许多实验室开始利用非放射性物质来取代放射性同位素。如生物素、地高辛、银染法、荧光标记物等化学发光物生物素、地高辛、银染法、荧光标记物等化学发光物 。在双脱氧法测序时，它们作为标记物，示踪测序反应的产物，最后通过酶显色反应或者荧光信号显示出测序的结果。这些方法比传统的放射性同位素方法检测容易、安全、快速、费用也低。
经典的双脱氧链末端终止法测序技术的改进
电泳方法的改进: 电泳方法的改进主要采用毛细管电泳法。 毛细管电泳是被分离物质在毛细管中的电泳。1992年，matnies等首先提出陈列毛细管电泳法，采用激光聚焦荧光扫描检测装置。25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5小时内可读出350bp。dna序列分析效率可达6000bp/h 。
2.测序过程: dna sequencing with genomelab tm
1.分离纯化模板dna*
2.dna模板定量分析*
3.测序反应*
4.测序反应后纯化* *
5.on-line变性*
6.毛细管电泳和检测*
7.数据分析*
分离纯化模板dna
• 1) 应用质粒提取试剂盒或者切胶纯化的方法得到相应的质粒模板或者pcr产物；
• 2) 将dna储存在灭菌水里如ddh2o, 18.2mωh2o超纯水；
注意：不要使用 depc 处理的水，水中不能有edta ，否则将抑制测序反应
• 3) 通过紫外分光光度计定量dna模板，dna模板的浓度应该> 0.1ug/ul；
• 4) 通过琼脂糖凝胶电泳检查dna模板的质量。
测序反应后纯化
去掉反应产物中的dntp,ddntp 和盐分
• 乙醇沉淀 ( 利用96 孔板离心机）
测序反应后纯化
纯化得到 dna测序反应产物
dna测序仪检测
荧光标记的dna链按从小到大的顺序被毛细管电泳分离。
激光诱导的荧光终止剂被检测器识别，直接阅读dna的核苷酸序列
typical sequencing result
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