技术专题
老师，这是我的满分实验报告！
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2020-06-01 16:58
一、实验原理
凝胶迁移或电泳迁移率实验 (electrophoretic mobility shift assay，emsa)是一种研究dna结合蛋白和其相关的dna结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析(hellman lm and fried mg, 2007)。这一技术最初用于研究dna结合蛋白，目前也可用于研究rna结合蛋白和特定的rna序列的相互作用 (rio, 2018)。
在实验中，通常将纯化的蛋白或细胞粗提液和生物素标记的dna或rna探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。其中dna-复合物或rna-复合物比非结合的探针移动得慢，而探针移动的较快。
图1 emsa原理图
二、实验目的
对探针和蛋白进行互做验证
三、主要仪器
dycp-32a核酸电泳仪
gnp-9080型恒温培养箱
gl-21m型高速冷冻离心机
dk-42恒温水浴锅
forma3111型细胞培养箱
jy92-iin型细胞超声破碎仪
zqwy-200型恒温振荡器
四、 实验步骤
样本制备
探针标记及检测
形成蛋白-探针复合物
制备凝胶、电泳
转膜
检测
五、课后习题及解答
1.研究蛋白-核酸互作有哪些技术？
答：凝胶电泳迁移率（emsa）、染色质免疫沉淀（chip）、rna pull down / dna pull down、双荧光素酶报告基因、酵母单杂交。
2、为什么实验背景高？
答：1）tbe溶液中有悬浮物；2）曝光或者成像时间过长；3）蛋白的质量不高，杂质多；4）没有清洗干净；5）实验过程中膜没有一直处于湿润状态；6）封闭时间不足或者效率不高。
3、探针的存储条件？
答：为防止探针降解，探针应保存在 -20 ℃。
4、为什么看不到迁移带？
答：1）蛋白降解或者提取量不足；2）标记的dna探针量太少或者样本中没有可以与探针结合的蛋白；3）探针降解或者探针与蛋白无特异性互作；4）曝光或成像时间过短；5）转膜效率低或者未转过来。
5. western blot和emsa有什么不同的意义
答：western blot 只能反应含量，不能反应待测分子的生物学活性。emsa是蛋白分子与靶序列核酸的结合量，反应的是该分子的生物学活性。
6.在dna探针的选择上，要考虑哪些重要因素？
答：1）目的dna的长度应小于300bp；2） 如目的蛋白已被鉴定，应该使用短的寡核苷酸片段；3）长的限制性酶切片段可用于对特定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位 。
六、考试重点
1.金开瑞emsa技术金开瑞emsa技术
金开瑞提供emsa检测技术服务，帮助您检测dna结合蛋白、rna结合蛋白、特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。
2技术流程技术流程
接收订单及样品 、实验设计、合成探针、emsa电泳凝胶配置、emsa反应、电泳检测、显色反应 、结果交付
3客户提供
1）.需提取核蛋白的细胞＞107，动物组织不少于400 mg，植物组织不少于2 g，建议客户在金开瑞表达重组蛋白；
2.）探针序列；如使用结合蛋白特异性抗体，抗体50 μl以上，浓度大于0.5 mg/ml。
4 最终交付
实验报告，含完整的实验流程、实验结果数据及图片。
七、课外延伸
八、参考文献
hellman lm and fried mg, 2007. electrophoretic mobility shift assay (emsa) for detecting protein-nucleic acid interactions. nature protocols, 2(8):1849-61.
rio dc, 2018. electrophoretic mobility shift assays for rna-protein complexes.cold spring harb protoc, (4):435-40.
