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客户文章分享：在假单胞菌pf- 5中hfq对lipa表达的调控作用
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2017-12-14 16:25
题目：the role of hfq in regulation of lipa expression in pseudomonas protegens pf-5
期刊：scientific reports
影响因子：4.847 4.259
合作技术：emsa
研究背景
脂肪酶是一种重要的工业酶，它存在于多种动物、植物和微生物中。商业脂肪酶主要来源于微生物。目前，脂肪酶被用于食品、饮料、石油、洗涤剂、化妆品、纸张、污染控制和生物能源工业。然而，传统发酵条件的优化也不能克服细菌脂肪酶的生产过程中的问题。因此为了解决这些问题，有必要阐明其对脂肪酶的基因表达调控的分子机制。
假单胞菌脂肪酶是一种被研究的较清楚的脂肪酶。然而很少有针对脂肪酶表达调控的机制进行研究。hfq是一种广泛调控蛋白，能够影响细菌生存的各种生理过程，控制多种基因的表达，调节细菌的蠕动，参与细菌群感应系统的管理。在本研究中，通过敲除或过表达hfq和rsmy基因，研究hfq对脂肪酶表达的调控。研究发现，hfq在转录水平和翻译水平调节脂肪酶的表达，主要表现在转录水平的调控。同时hfq还调控rsmy的表达及维持rsmy的稳定性。将hfq / rsmy双基因敲除，发现hfq可以直接结合rsmy来调控脂肪酶的激活。总之，这项研究表明在假单胞菌pf - 5中，hfq通过在转录水平上调控rsmy的表达来影响脂肪酶的表达。
研究内容及结果
为了研究hfq和lipa之间的关系，本文先通过同源重组的方法敲除及突变hfq基因，得到四个基因的突变株。并通过pcr的方法检测基因敲降成功。将hfq突变后检测了pf-5的生长、脂肪酶的表达及活性，同时检测了β-半乳糖苷酶的活性。实验结果显示hfq被突变后，单胞菌pf-5生长水平受到抑制，脂肪酶转录水平表达受到抑制，同时脂肪酶活性显著降低，β-半乳糖苷酶的活性也显著降低。
期刊：scientific reports
影响因子：4.847 4.259
合作技术：emsa
研究背景
脂肪酶是一种重要的工业酶，它存在于多种动物、植物和微生物中。商业脂肪酶主要来源于微生物。目前，脂肪酶被用于食品、饮料、石油、洗涤剂、化妆品、纸张、污染控制和生物能源工业。然而，传统发酵条件的优化也不能克服细菌脂肪酶的生产过程中的问题。因此为了解决这些问题，有必要阐明其对脂肪酶的基因表达调控的分子机制。
假单胞菌脂肪酶是一种被研究的较清楚的脂肪酶。然而很少有针对脂肪酶表达调控的机制进行研究。hfq是一种广泛调控蛋白，能够影响细菌生存的各种生理过程，控制多种基因的表达，调节细菌的蠕动，参与细菌群感应系统的管理。在本研究中，通过敲除或过表达hfq和rsmy基因，研究hfq对脂肪酶表达的调控。研究发现，hfq在转录水平和翻译水平调节脂肪酶的表达，主要表现在转录水平的调控。同时hfq还调控rsmy的表达及维持rsmy的稳定性。将hfq / rsmy双基因敲除，发现hfq可以直接结合rsmy来调控脂肪酶的激活。总之，这项研究表明在假单胞菌pf - 5中，hfq通过在转录水平上调控rsmy的表达来影响脂肪酶的表达。
研究内容及结果
为了研究hfq和lipa之间的关系，本文先通过同源重组的方法敲除及突变hfq基因，得到四个基因的突变株。并通过pcr的方法检测基因敲降成功。将hfq突变后检测了pf-5的生长、脂肪酶的表达及活性，同时检测了β-半乳糖苷酶的活性。实验结果显示hfq被突变后，单胞菌pf-5生长水平受到抑制，脂肪酶转录水平表达受到抑制，同时脂肪酶活性显著降低，β-半乳糖苷酶的活性也显著降低。
在野生型假单胞菌pf- 5中，通过同源重组的方法过表达hfq，恢复了hfq突变体中脂肪酶的相对活性，结果表明hfq基因敲除在启动子水平上影响脂肪酶表达以及活性。此外，在hfq突变型中过表达hfq后检测脂肪酶和β-半乳糖苷酶的活性，结果显示与野生型相比，这两种酶的活性都恢复了。这些结果说明hfq在转录水平和翻译水平参与lipa的表达以及脂肪酶表达的调控。
将phrs、rsma，rsme、remy、rsmz的启动子构建到lacz报告基因的启动子区域，转染进hfq敲降后的假单胞菌，检测β-半乳糖苷酶活性。结果显示，转染phrs、rsma，rsme重组质粒后β-半乳糖苷酶的活性没有变化，rsmz的活性发生了轻微的变化，而rsmy的活性变化很明显。这些结果表明hfq可能通过remy或rsmz影响lipa的表达。
使用纯化后的hfq蛋白，通过emsa实验进一步研究hfq与rsmy是否结合。emsa实验结果显示hfq不能与rsma、rsme、rsmz的启动子序列结合，但是可以与rsmy结合。竞争性emsa实验结果显示，随着非标记rsmy探针浓度增加，与hfq蛋白结合的标记探针越来越少，这个结果说明hfq蛋白可以与rsmy结合。
据报道，hfq和rsmy的结合可以维持rsmy的稳定。然而，在pf - 5中，hfq没有被研究过。因此本文先研究了利福平处理后，pf-5野生型和hfq突变株中rsmy的稳定性变化。结果表明，与野生型相比，hfq突变体中rsmy的稳定性明显降低。这个结果显示hfq通过调节rsmy的稳定性来影响表达rsmy，进而影响脂肪酶的表达。
通过pcr确定rsmy基因被敲除后(图6a)，对脂肪酶表达进行了测定，验证了rsmy在调节脂肪酶表达中的作用。实验结果hfq被敲除的细胞中脂肪酶表达量减少。hfq和rsmy 都被敲除的细胞内，脂肪酶表达量显著下调(图6b和c)。此外，在hfq突变体中，将rsmy恢复表达，结果显示脂肪酶的表达水平与野生型表达水平相似。在野生型和hfq突变型菌株中，过表达rsmy后lipa的表达水平都显著上调。
文章小结
1. hfq基因被敲降后，pf-5菌株中脂肪酶的表达量显著下调，同时细菌生长受到抑制，说明hfq调控lipa的表达和脂肪酶的活性。
2. hfq可能通过remy或rsmz影响lipa的表达。
3. emsa实验表明hfq蛋白可以与rsmy结合。
4. hfq通过调节rsmy的稳定性来影响表达rsmy，进而影响脂肪酶的表达。
5. hfq通过在转录水平上调控rsmy的表达来影响脂肪酶的表达。
解析文献
wu liu, menggang li, et al. the role of hfq in regulation of lipa expression in pseudomonas protegens pf-5. scientific. reports. 7 (1) :10356(2017).
1. hfq基因被敲降后，pf-5菌株中脂肪酶的表达量显著下调，同时细菌生长受到抑制，说明hfq调控lipa的表达和脂肪酶的活性。
2. hfq可能通过remy或rsmz影响lipa的表达。
3. emsa实验表明hfq蛋白可以与rsmy结合。
4. hfq通过调节rsmy的稳定性来影响表达rsmy，进而影响脂肪酶的表达。
5. hfq通过在转录水平上调控rsmy的表达来影响脂肪酶的表达。
解析文献
wu liu, menggang li, et al. the role of hfq in regulation of lipa expression in pseudomonas protegens pf-5. scientific. reports. 7 (1) :10356(2017).
参考文献
1. houde, a., kademi, a. & leblanc, d. lipases and their industrial applications: an overview. appl. biochem. biotechnol. 118, 155–70(2004).
2. soberon-chavez, g. & palmeros, b. pseudomonas lipases: molecular genetics and potential industrial applications. crit. rev. microbiol. 20, 95–105 (1994).
3. krzeslak, j., gerritse, g., van merkerk, r., cool, r. h. & quax, w. j. lipase expression in pseudomonas alcaligenes is under the control of a two-component regulatory system. appl. environ. microbiol. 74, 1402–11 (2008).
4. rosenau, f. & jaeger, k. bacterial lipases from pseudomonas: regulation of gene expression and mechanisms of secretion. biochimie82, 1023–32 (2000).
1. houde, a., kademi, a. & leblanc, d. lipases and their industrial applications: an overview. appl. biochem. biotechnol. 118, 155–70(2004).
2. soberon-chavez, g. & palmeros, b. pseudomonas lipases: molecular genetics and potential industrial applications. crit. rev. microbiol. 20, 95–105 (1994).
3. krzeslak, j., gerritse, g., van merkerk, r., cool, r. h. & quax, w. j. lipase expression in pseudomonas alcaligenes is under the control of a two-component regulatory system. appl. environ. microbiol. 74, 1402–11 (2008).
4. rosenau, f. & jaeger, k. bacterial lipases from pseudomonas: regulation of gene expression and mechanisms of secretion. biochimie82, 1023–32 (2000).