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客户文章分享：茄科劳尔氏菌作用因子ripak通过抑制宿主过氧化氢酶活性抑制植物超敏反应
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2017-07-17 09:16
基本信息
题目：the ralstonia solanacearum effector ripak suppresses plant hypersensitive response by inhibiting the activity of host catalases（茄科劳尔氏菌作用因子ripak通过抑制宿主过氧化氢酶活性抑制植物超敏反应）
期刊：cellular microbiology
影响因子：4.76
主要技术：无细胞表达系统
期刊：cellular microbiology
影响因子：4.76
主要技术：无细胞表达系统
研究背景
植物的免疫系统和病原菌在生存竞争中不断演化出克服对方的策略，例如病原菌分泌一些作用因子抑制植物免疫系统，植物则通过表达r蛋白对此进行反抗引起植物的作用因子激发免疫（eti）。eti与植物的超敏反应（hr）相关，即细胞产生大量活性氧物质（ros）激发细胞死亡。ros中的h2o2主要产生于过氧化物酶体——光呼吸作用的关键细胞器。最近的研究表明，光呼吸作用与植物抵抗病原菌具有密切关系，且过氧化物酶（cat）在植物的免疫机制中起到重要作用，然而cat对病原菌感染的调控机制尚未明确。
同许多其他病原菌一样，劳尔氏菌gmi1000菌株能分泌70多种iii型作用因子，统称为rips，其中一些在致病过程中起到重要作用，而多数rips功能尚且未知。近来中山大学研究室对rips成员之一ripak的功能进行了探索，研究发现ripak通过与植物过氧化物酶体的cats直接作用，抑制cat的活性，在植物早期防御应激阶段起到抑制植物的免疫效应的关键作用。
同许多其他病原菌一样，劳尔氏菌gmi1000菌株能分泌70多种iii型作用因子，统称为rips，其中一些在致病过程中起到重要作用，而多数rips功能尚且未知。近来中山大学研究室对rips成员之一ripak的功能进行了探索，研究发现ripak通过与植物过氧化物酶体的cats直接作用，抑制cat的活性，在植物早期防御应激阶段起到抑制植物的免疫效应的关键作用。
研究内容及结果
1. ripak对抑制植物超敏反应的影响
作者将不同菌株接种到烟草叶片，发现转染了ripak的ripak敲除菌株（rsδripak+ripak）能抑制植物的免疫响应（下图b rsδripak+ripak），形成更多菌落。ripak的七个区段对其功能都起着至关重要的作用，缺乏其中一个均会激发hr导致感染菌株被植物清除（下图e形成白色坏死区域）。
作者将不同菌株接种到烟草叶片，发现转染了ripak的ripak敲除菌株（rsδripak+ripak）能抑制植物的免疫响应（下图b rsδripak+ripak），形成更多菌落。ripak的七个区段对其功能都起着至关重要的作用，缺乏其中一个均会激发hr导致感染菌株被植物清除（下图e形成白色坏死区域）。
2. ripak亚细胞定位分析
作者利用双分子荧光互补实验验证了ripak蛋白定位于植物的超氧化物酶体（下图pst1-rfp红色荧光是定位于过氧化物酶体的参照），且ripak蛋白m区和p区对定位是必不可少的。
作者利用双分子荧光互补实验验证了ripak蛋白定位于植物的超氧化物酶体（下图pst1-rfp红色荧光是定位于过氧化物酶体的参照），且ripak蛋白m区和p区对定位是必不可少的。
3. ripak与cat互作分析
质谱鉴定mbp pull down差异蛋白（下图a中红色条带）发现ripak互作的差异蛋白包括cat2，后续作者利用酵母双杂发现ripak的m区段、p区段与cat2的h65在二者结合时起着关键性作用。在拟南芥中应用bifc也验证了ripak和cats的互作（下图d）。
质谱鉴定mbp pull down差异蛋白（下图a中红色条带）发现ripak互作的差异蛋白包括cat2，后续作者利用酵母双杂发现ripak的m区段、p区段与cat2的h65在二者结合时起着关键性作用。在拟南芥中应用bifc也验证了ripak和cats的互作（下图d）。
4. ripak对cat活性影响
作者用酵母细胞分析h2o2存在的情况下细胞内ripak对cat2的活性抑制作用，发现ripak对cat2的活性起到一定的抑制作用，且m或p区段的缺失都使ripak的抑制活性丧失。
作者用酵母细胞分析h2o2存在的情况下细胞内ripak对cat2的活性抑制作用，发现ripak对cat2的活性起到一定的抑制作用，且m或p区段的缺失都使ripak的抑制活性丧失。
体外的cat活性测试，需要纯化的ripak蛋白，由于该蛋白为跨膜蛋白表达难度较高，作者用我司以无细胞表达系统成功表达的ripak蛋白进行体外实验测定cat活性（试剂盒法），发现重组表达的ripak具有抑制cat活性的作用。
5. 感染样本的转录组分析及荧光定量pcr分析
作者对感染早期的烟草叶片进行高通量rna测序及go、ipr、kegg分析发现，感染2 h时光呼吸作用相关基因出现高表达，某些次级代谢产物合成通路相关蛋白则表达下调，感染4 h时更多的次级代谢产物合成通路相关蛋白表达下调，与植物免疫防御相关的蛋白如细胞色素p450、dna结合wrky蛋白也表达下调。qrt-pcr分析结果显示在感染早期，与植物免疫相关的标记基因出现显著下调，而ntcat1（对应于拟南芥atcat2）的表达在2 h时上调1.4倍，在4 h时上调5.2倍，这可能是一种补偿机制。这些结果说明，在感染早期ripak通过抑制cat活性抑制植物的免疫系统。
作者对感染早期的烟草叶片进行高通量rna测序及go、ipr、kegg分析发现，感染2 h时光呼吸作用相关基因出现高表达，某些次级代谢产物合成通路相关蛋白则表达下调，感染4 h时更多的次级代谢产物合成通路相关蛋白表达下调，与植物免疫防御相关的蛋白如细胞色素p450、dna结合wrky蛋白也表达下调。qrt-pcr分析结果显示在感染早期，与植物免疫相关的标记基因出现显著下调，而ntcat1（对应于拟南芥atcat2）的表达在2 h时上调1.4倍，在4 h时上调5.2倍，这可能是一种补偿机制。这些结果说明，在感染早期ripak通过抑制cat活性抑制植物的免疫系统。
文章小结
近年来过氧化物酶体及cat与植物免疫系统的关系越来越受到研究者的重视，该文章使用多种技术研究ripak与植物cat直接的密切联系，揭示了ripak对cat的活性抑制引起ros介导信号通路的激活，从而抑制植物早期的免疫系统响应，该研究成果对探索cats等氧化物还原酶调节植物免疫应激具有重要意义。
文献来源
yunhao sun, pai li, mengying deng, dong shen, guangyi dai, nan yao, yongjun lu. the ralstonia solanacearum effector ripak suppresses plant hypersensitive response by inhibiting the activity of host catalases. cell microbiol. 2017 mar 2. doi: 10.1111/cmi.12736.