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cancer research！nfat1- ndel1轴将成为神经胶质瘤治疗策略的重要目标
文章来源：genecreate
作者：genecreate
发布时间：2019-05-27 09:50
题目：nfat1-mediated regulation of ndel1 promotes growth and invasion of glioma
stem-like cells
期刊：cancer research（if=9.13）
合作技术：细胞系培养和鉴定
研究背景
神经胶质瘤是成人最常见、最难治疗的原发性脑肿瘤，其肿瘤的发生发展与胶质瘤干细胞（gscs）相关，因此针对这种细胞亚群的研究有利于胶质瘤的临床治疗。鉴于gscs位于特殊的微环境中，且其诱导和维持机制在很大程度上仍然是未知的，所以揭示促使gscs迁移侵袭和自我更新的分子机制对于gscs定向治疗的发展具有重要意义。在本篇文献中，作者深入研究活化t细胞-1的钙反应转录因子（nfat1）在gscs中的作用，并报告了一种新的gscs维持途径，即nfat1- ndel1轴（ndel1是nfat1下游靶点，神经发育蛋白1）将成为神经胶质瘤治疗策略的重要目标。
研究内容及结果
1.神经胶质瘤的临床病理特征与nfat1表达量有关
在前期胶质母细胞瘤中nfat1系列研究基础上，作者根据tcga（癌症和肿瘤基因图谱）和gravendeel（公开的临床数据集）统计发现，神经胶质瘤的间充质亚型中nfat1表达水平高于其他几种亚型（图1a），且nfat1表达不仅与干细胞基因（cd44/vimentin）和间质转化相关基因（rel/lyn/tgfbr2）表达显著相关，也与胶质瘤的预后较缓相关（图1b-1c）。接下来，从新鲜的临床多形性胶质母细胞瘤（gbm）等样本中分离出gscs，进行细胞系鉴定和富集培养，通过rt-qrcr和免疫荧光染色实验发现，nfat1高表达与胶质瘤的恶性亚型和gscs的生长侵袭有关（图1d-1e）。
图1 nfat1表达与神经胶质瘤的临床病理特征的关系
2.nfat1影响gscs的生长和侵袭
为确定nfat1对gscs的生理影响，一方面，采用两个独立的shrnas分别去转导高表达nfat1的ln229和g10 gscs细胞。wb结果证实，其中一个nfat1 shrnas (shnfat1-2) 转导ln229和g10 gscs后nfat1减少了80%以上（图2a）；体外细胞活性测定和流式分析显示，nfat1沉默显著地降低gscs的活性并诱导细胞凋亡（图2b-2c）；此外，通过伤口愈合分析、transwell分析和三维球体侵入分析得到，shnfat1-2感染gscs后细胞迁移和侵入行为显著减少，且gscs球体形成能力下降（图2d-2g）。
另一方面，在基础水平较低的t98g和g03 gscs中实现nfat1过表达（图3a）。通过一系列细胞生物学检测得到，nfat1过表达显著地增强细胞活性并抑制凋亡（图3b-3c）、增加了gscs的迁移和入侵（图3d-3f）；同时电镜图显示nfat1刺激gscs的神经球的形成过程（图4g）。
图2 nfat1的沉默抑制gscs的生长和侵袭
图3 nfat1的过表达促进gscs的生长和侵袭
3. nfat1对体内gscs肿瘤生长具有重要意义
采用颅内小鼠模型，探究nfat1沉默和过表达对体内gscs肿瘤生长的影响。大脑切片染色结果显示，与对照shrna相比，nfat1的敲除组显著地抑制颅内肿瘤生长（图4a-4b）；kaplan–meier生存曲线显示t98g和g03 gscs的细胞生存率增加，进而可推测出nfat1 shrnas（shnfat1-1和shnfat1-2）将更有效地延长小鼠生存期（图4c-4f）。综上所述，nfat1在体外和体内都促进gscs的肿瘤发生。
图4 nfat1表达影响体内gscs的生长
4.ndel1鉴定为nfat1下游靶基因
通过开展转录组测序来确定nfat1的潜在下游靶点，从热图数据中分别初筛出50个nfat1沉默后下调基因和nfat1过表达后上调的基因，上述均有可能是nfat1介导的肿瘤促进基因（图5a-5b）；结合tcga和gravendel数据集的生物信息学分析，发现ndel1表达量在复发性gbms中显著地上调且涉及到间质过渡和干度增加的生理过程（图5c-5d），同时也发现间充质gscs细胞的ndel1表达水平明显高于原神经性gscs细胞（图5e-5f）。与此同时，在挖掘rembrandt补充数据集后发现，ndel1表达不仅与gbms低存活率相关，还参与胶质瘤的恶性进展。
图5 神经胶质瘤表达与临床病理特征的关联
5.ndel1由nfat1转录调节并参与gscs的发生发展
通过蛋白质印迹分析初步验证转录组的数据，nfat1的沉默显著地降低了ndel1的表达，且nfat1的过表达显著地增加了ndel1的表达（图6a-6b）；双标记免疫荧光染色测定出在g10 gsc中nfat1对ndel1具有调节作用（图6c-6d）；采用荧光素酶分析法检测naft1对ndel1启动子活性的影响，结合chip-qpcr芯片分析得出nfat与ndel1启动子结合（图6e-6g）。鉴于ndel1在gscs生长和入侵中的作用机制尚未确定，由此使用两个独立的shrnas来稳定地沉默g10 gscs的ndel1（图6h）；陆续通过wb检测、流式分析、基质凝胶分析、三维球体侵入分析得到，ndel1的沉默显著降低了g10 gscs的侵入能力，且在很大程度上抑制了g10 gscs的自我更新能力（图6i-6m）。
图6 ndel1由nfat1的转录调节
6.在nfat1沉默的gscs中ndel1重新表达可部分恢复肿瘤生长和侵袭
为了进一步研究nfat1是否通过调节ndel1表达来部分支持gscs的攻击行为，作者在fat1沉默的g10 gscs中建立ndel1重新表达的体系（图7a），发现ndel1重新表达可部分恢复gscs的生理活性，并减少了nfat1沉默诱导的细胞凋亡（图7b-7c）。根据基质凝胶分析、三维球体侵入分析和神经球形成检测，得到nfat1敲除后抑制的gscs侵袭作用被ndel1重新表达所挽救（图7d-7e）并恢复了自我更新能力（图7f-7g）；此外，大脑切片染色等体内验证实验表明，通过ndel1重新表达仅部分非完全地缓解nfat1基因敲除后体内肿瘤生长的抑制效应，也很可能涉及更多的未知途径。
图7 在nfat1沉默的gscs中ndel1重新表达可恢复体外和体内的肿瘤生长
文章小结
本文旨在探讨nfat1在神经胶质瘤中的调节机制，通过基因敲除和过表达进行初步验证，发现nfat1表达与胶质瘤的侵袭性表型和生存率相关；rna测序显示nfat1的缺失与ndel1表达关联；结合挽救实验说明nfat1调控了ndel1的启动子活性，nfat1-ndel1信号上调后激活erk去提高gscs干细胞标志物的蛋白水平和细胞分化水平。综上所述，nfat1通过调节ndel1去部分控制gscs的生长和侵袭，以nfat1-ndel1轴为靶点可为胶质瘤患者提供较大可能的治疗机会。
解析文献
jiang y, song yf, wang r, et al. nfat1-mediated regulation of ndel1 promotes growth and invasion of glioma stem-like cells. cancer res. 2019 apr 2，doi: 10.1158/0008-5472.can-18-3297.