引物合成的步骤及方法介绍-8846威尼斯

        oligo dna的人工化学合成始于50年代初期，1980年，全自动的固相dna合成仪面市后，使得快速、高效合成oligo dna成为可能，这大大地推动了生物工程技术的蓬勃发展。

        现在一般都采用β-乙腈亚磷酰胺化学合成oligo dna，将dna固定在固相载体上完成dna链的合成的合成时从3' →5' 方向进行，通常3' 端的第一个碱基结合在glass担体 (controlled pore glass，cpg)上。其具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

 

合成步骤

step1：脱掉附加在cpg担体上的第一个碱基5' -oh基团上的保护基 (dmtr)，准备附加下一个新的碱基；

step2：活化新的碱基单体 (phosphoramidite)，准备与第一个碱基进行反应；

step3：第二个碱基与第一个碱基发生偶联反应；

step4：将没有反应的第一个碱基的5' -oh加帽封死 (capping)，使其不再进一步参与反应；

step5：将核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯 (即将三价磷氧化成五价磷)。

step6：重复进行step1～step5的循环，直至合成完所需的oligo dna序列。

step7:合成结束后，将oligo dna分子从cpg上切下，再进行进一步的纯化。
 

图1 oligo dna合成原理。n1代表第一个碱基，n2代表第二个碱基，依此类推。

od数的确定

        一般pcr扩增，2 od引物，可以做200-500次50ul标准pcr反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 od就足够了。但是有些研究人员，就做几次pcr，但是却要5-10 od。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高od数。片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的od数要求，也是一种浪费。

 

引物纯度检测

        实验室方便的作法是用page方法。使用加有7m尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5od的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600v电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光tlc板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用eb 染色或银染方式染色。

引物级别选择

应用	引物长度要求	纯度级别要求
一般pcr扩增	< 45 base	page
诊断pcr扩增	< 40 base	opc，page
dna测序	20 base左右	opc
亚克隆，点突变等	根据实验要求	opc，page，hplc
基因构建（全基因合成）	根据实验要求	page
反义核酸	根据实验要求	page
修饰引物	根据实验要求	page，hplc