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【客户文献解读】if=7.543，多组学联用结合互作技术确定rps4y1是vkh疾病中重要的csa和cs抗性基因
文章来源：未知
作者：genecreate
发布时间：2020-06-19 10:58
题目：identification of ribosomal protein s4, y-linked 1 as a cyclosporin a plus corticosteroid resistance gene
期刊：journal of autoimmunity
影响因子(if)：7.543
研究背景
皮质类固醇(cs)联合环孢素a (csa)被广泛用于治疗自身免疫性疾病、自身炎症性疾病和移植排斥反应。然而，一些患者对联合治疗方案没有反应或产生耐药性。在vogt-koyanagi-harada (vkh)疾病模型中，通过转录组学(rna-seq)、蛋白质组学(itraq)体外检测等一系列实验，以筛选和验证潜在的耐药分子。研究发现在csa、cs耐药和-敏感的vkh患者来源的cd4 t淋巴细胞中共有1697个差异表达基因(degs)和21个差异表达蛋白(deps)。核糖体蛋白s4和y-linked 1 (rps4y1)被证实调节男性vkh患者cd4 t淋巴细胞对csa和cs的抗性。作者发现clb可以通过抑制rps4y1逆转抗性。综上所述，确定rps4y1是vkh疾病中重要的csa和cs抗性基因。
研究内容及结果
1. csa和csa耐药及敏感vkh患者cd4 t细胞的转录和蛋白谱分析
作者应用rna-seq技术检测来自12例耐药患者及19例敏感患者分离的cd4 t淋巴细胞mrna表达水平的差异。与敏感患者相比，作者发现1697个差异表达耐药患者的基因（degs）（1.2倍变化，fdr<0.05）。其中822个基因上调表达，875个基因下调表达（图1a）。
作者还运用蛋白质组学(itraq)开展了类似研究，发现与敏感患者相比，在耐药患者中发现21个差异表达蛋白（6个上调表达，15个下调表达（图1c））（deps）（1.2倍变化，p<0.05）。omicsbean对degs和deps进行了功能分析(go及kegg) (http://www.omicsbean.cn)。degs 的go分析结果显示：4604个生物过程(bp)，499个细胞成分(cc)，631个分子功能的功能通路被富集出来；此外26条kegg通路被富集出来（图1b）。deps 的go分析显示422个bps，93个ccs，38个mfs及 13个kegg功能通路被富集出来（图1d）。从go和kegg富集出来的通路可以看到，差异基因及蛋白主要是与炎症和免疫功能相关的，如nf-kappa b、抗原处理和递呈及mapk等途径。
图1 耐药和敏感vkh患者cd4 t细胞的转录组和蛋白质组分析
（a） 火山图显示差异基因，与敏感患者相比，耐药患者的基因上调（红色）或下调（绿色）被认为是fdr<0.05，两者之间的倍数变化>1.2两组；
（b） go和kegg对degs的功能通路富集，p<0.05被认为是显著的富集；
（c） 火山图显示与敏感患者相比，耐药患者中的蛋白质显著上调（红色）或下调（绿色）的deps被认为是p<0.05，且两者之间的倍数变化>1.2两组；
（d） go和kegg对deps的富集，p<0.05为显著富集。deps：差异表达蛋白质。
2. 转录组与蛋白质组联合分析
通过对两个omics数据集（242个无注释）的综合分析作者发现：rps4y1和hla-dqa1在mrna和蛋白质水平上差异表达（图2a）。与敏感患者相比，基因及蛋白层面结果均显示rps4y1在耐药患者中上调，而hla-dqa1下调（图2b）。此外，生物信息学分析显示两个候选基因参与了45个重要bps，9个ccs，4个mfs和1重要的kegg途径（图2c）。go富集分析显示两个基因的详细功能分类并对其进行展示（图2d）。
图2 转录组与蛋白质组学联合分析
（a） vene图重叠部分显示候选分子rps4y1和hla-dqa1在两个omics数据集。
（b） rps4y1和hla-dqa1mrnas与蛋白的相关性。
（c） 对rps4y1和hla-dqa1进行富集分析，p<0.05为显著富集。
（d） go富集的详细功能分类。
3. rps4y1是vkh病中一个潜在的cs a和cs抗性基因研究
针对多组学联合分析筛选到的两个基因，作者进一步通过rt-qpcr和prm分别进行反向验证，检测结果显示：rps4y1和hla-dqa1的蛋白表达趋势与转录组实验结果保持一致。rt-qpcr结果显示：rps4y1在男性耐药患者表达上调（图3a），prm结果显示相同的表达模式（图3c和d）。另一方面，prm结果显示耐药患者hla-dqa1蛋白表达下降（图3c和d），与蛋白质组实验结果保持一致。rt-qpcr结果显示耐药与非耐药患者hla-dqa1基因表达无显著性差异(p>0.05)。（图3b）。
图3 rps4y1和hla-dqa1的验证
（a和b）rt-qpcr法检测rps4y1（a）和hla-dqa1
（b）的mrna表达，gapdh做内参对照，11例男性耐药，10例男性敏感患者检测rps4y1，17例耐药，21例敏感患者检测hla-dqa1检测。（c） prm用于验证蛋白质rps4y1（男性患者）和hla-dqa1的水平，用r/s比值表示两组间蛋白水平的倍数变化，r表示耐药患者s代表敏感病人。
（b）的mrna表达，gapdh做内参对照，11例男性耐药，10例男性敏感患者检测rps4y1，17例耐药，21例敏感患者检测hla-dqa1检测。（c） prm用于验证蛋白质rps4y1（男性患者）和hla-dqa1的水平，用r/s比值表示两组间蛋白水平的倍数变化，r表示耐药患者s代表敏感病人。
（d） itraq与prm结果的比较。
4. rps4y1对cd4 t细胞体外抗csa和cs的调节作用
根据组学及验证结果，作者推测rps4y1可能对csa及cs耐药性有一定的调节作用并进行功能检测实验进行验证。
通过转染过表达慢病毒感染cd4 t细胞（来源于5个男性敏感病人），同时构建干扰sirna进行干扰实验转染cd4 t细胞（来源于8个男性耐药病人）。作者通过流式细胞术检测il-17 和ifn-γ cd4 t淋巴细胞，elisa实验检测il-17和ifn-γ细胞上清含量。结果显示csa和dex对ifn-γ cd4 t细胞量无明显影响（图4a和b）。沉默rps4y1后csa和dex对细胞数量有下调影响。
图4 rps4y1在体外调节cd4 t细胞对csa和cs的抵抗
（a）流式细胞仪检测il-17 和ifn-γ cd4 t细胞占比；（b）elisa法检测8例男性耐药患者cd4 t细胞培养上清液中ifn-γ的产生；
（c和d）（c）流式细胞检测il-17 和ifn-γ cd4 t细胞的细胞占比
（c）和（d）elisa检测上清ifn-γ的含量。
5. clb（苯丁酸氮芥）通过抑制rps4y1的表达进而抑制vkh患者对csa和cs的耐药性
作者为探究clb对耐药患者作用的机制探，对来自于9个男性抵抗者的cd4 t细胞进行不同方式的治疗分组：包括dmso（对照）、csa和dex（处理组1）、clb和clb加csa&dex治疗（处理组2）。结果表明，与dmso对照组相比，治疗组ifn-γ cd4 t细胞占比明显升高；clb加环孢素a和地塞米松治疗组降低，轻度clb治疗组减少但无统计学意义（图5a）。同时，elisa试验的结果也显示了同样的趋势（图5b）。与对照组相比，csa和dex药物处理组中ifn-γ cd4 t细胞的数量占比及inf-γ的含量并没有受到影响（图5a和b）。il-17 cd4 t细胞及il-17的含量也没有显著性差异变化（图5a）。预示着clb可能起着一个辅助的功能，并推测这种功能是由于抑制了rps4y1功能或者表达水平引起的。
作者进一步通过rt-qpcr检测证实与对照组相比，添加clb药物处理后rps4y1的基因表达量下降，同时只添加clb药物组的表达量最低（fig.5c）。这种情况在蛋白层面同样得到了验证（fig.5d）。作者同时观察到经csa & dex处理组样本中rps4y1基因及蛋白表达相对于dmso对照组略微上调（fig.5c 和d）。进一步通过挽救实验显示，clb联合csa、dex治疗对ifn-γ cd4 t占比率及ifn-γ的含量的抑制效果在加入rps4y1过表达后消失了（fig5e-g）。综合以上结果显示：clb通过抑制rps4y1的表达抵消vkh患者对csa及cs的耐药性。
图5 clb通过降低rps4y1的表达逆转vkh患者cd4 t细胞对csa和cs的抗性。
（a）流式细胞检测ifn-γ cd4 t细胞，（b）elisa检测9例男性耐药患者经dmso，csa&dex，clb，clb&csa&dex. 孵育后cd4 t细胞上清液中ifn-γ的产生
（c）rt-qpcr检测rps4y1的mrna水平；（d）western blot检测rps4y1的蛋白水平；
（e）western blot检测rps4y1蛋白；
（f）流式细胞实验检测ifn-γ cd4 t细胞的频率。
小结
作者确定rps4y1是csa和cs抗性基因。并通过功能实验及挽救实验探索了关于rps4y1如何表达增加控制耐药。进一步的证据发现rps4y1在控制耐药性中的作用是通过对药物clb辅助及rps4y1表达降低有关。作者的研究是专注于vkh疾病，但也可应用于其他环境csa和cs抵抗，包括其他自身免疫性疾病或器官移植，为后续临床耐药基因的筛选及研究提供了鉴定的理论基础，具有极其重要的研究意义。
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