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rna pull down使用体外转录法标记生物素rna探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成rna-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的rna结合蛋白是否与rna相互作用。

蛋白质与rna的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mrna组装、病毒复制、细胞发育调控等。若待检测目的蛋白明确，选择western blot鉴定；若不明确，则可选择质谱鉴定。

金开瑞现提供rna pull down检测技术服务, 使用特异性二抗进行检测，能有效避免抗体重链对结果的信号干扰。并且金开瑞配套有世界上最先进的质谱仪，能显著提升检测效果。

rna pull down实验与lncrna的研究是分不开的，为lncrna生物学功能的验证起到了至关重要的作用。除此之外，金开瑞可提供的lncrna研究服务包括： lncrna在不同组织中表达水平的检测、lncrna特点探究、lncrna的功能研究、lncrna结合蛋白质的检测、mirna在lncrna的作用靶点预测及功能验证、lncrna表达调控的研究。

详情可参考长链非编码rna（lncrna）研究；

更多非编码rna研究方面可参考非编码rna研究方案。

lncrna的富集大致上有三种方法:

1) 探针法：针对该lncrna的序列，设计生物素标记的探针。此种方法最关键的是探针的特异性，所以最好用northern blot检测探针的特异性。 可以结合内源的lncrna是探针法的最大优势。缺点就是比较贵，需要的样品量大。

2) 生物素标记法：在lncrna的5‘端加上t7启动子，利用体外转录试剂盒，可以制备大量的lncrna。再通过生物素标记试剂盒，就能得到大量的生物素标记的lncrna。常用的折叠的方法退火，从95℃退火到4℃，大约30秒一度就可以了。

3) trsa法：除了生物素，链霉亲和素还可以识别trsa结构，因此在lncrna的一端加上trsa序列也是不错的选择。

可以，前提是circrna在细胞中表达丰度要高。

有，探针法和生物素标记法的对照都是相应的反义序列：探针的反义序列以及长非编码rna的反义序列。trsa法的对照是trsa序列本身。

rna pull down实验的一大难点就是rna本身易降解，所以过程中要禁止rnase,以防止降解。因此在整个实验过程中除了ep管、枪头、镊子这些常用的器具需要灭菌，所有试剂均需要depc•h2o配置并灭菌！处理后的耗材需要尽快用掉，超过两周则需要重新处理。操作台需要用rnasezap擦净，以去除环境中的rna酶的影响。

背景深需考虑是不是sds-page染色时间过长或者抗体的质量问题，多克隆抗体经常会出现这种情况，最有可能的情况是样品中包含的非特异性蛋白太多了，针对这一点，有以下解决措施：

1) 优化孵育时间、温度、盐浓度等条件；

2) 优化缓冲体系，使用严谨性高的缓冲体系；

3) 提高裂解液的质量。

可能的原因有以下几点：

1) 选取的组织或细胞样品其中互作蛋白表达量很低；

2) 体外转录得到的rna降解或者不是全长；

3) pull-down实验孵育时间不长。

可能的原因有以下几点：

1) 选取的rna序列不对；

2) 样品中没有表达互作的蛋白质；

3) 互作蛋白浓度低，银染图肉眼观察不到差异条带。

rna结合蛋白没有结合，可能是因为靶蛋白量不足或者rna探针和蛋白的亲和力本来就低，也可能缓冲体系不对。

解决办法包括有：

1) 增加上样蛋白量；

2) 应用低盐体系；

3) 加入交联试剂。

可能原因：结合缓冲环境没有优化、裂解不完全、磁珠用量不足、rna探针用量不足等。

解决办法：可优化孵育时间、温度、盐浓度等条件、增加裂解液和蛋白上样量的比例、适当改变磁珠及探针用量、增加裂解液、确定生物素和链霉亲和素效率等。

可能原因：

1)缓冲环境没有优化；

2)缓冲环境严谨性低；

3)样品没有裂解完全和裂解体系没有优化。

解决方法：

1)优化孵育时间温度盐浓度等条件；

2)使用严谨性高的缓冲体系；

3)调低rna探针和样品的比例；

4)提高裂解液的量。