「十问十答」酵母杂交通关攻略，全方位交流贴 -8846威尼斯

酵母杂交通关攻略

q:利用去除激活域的转录因子x作为诱饵，筛选到互作蛋白y。再利用x的全长蛋白导入ad载体，y导入bd载体，共转ah109的结果显示不互作。怎么解析？

a:这个问题可以从两个方面分析：1.确保第一次共转化验证是否是阳性，用y2h菌株替换ah109试试，ah109菌株相对更容易产生假阳性；2.确保初次验证是阳性结果，第二次验证是阴性结果，猜测可能是融合的相应的bd和ad的结构域蛋白包裹了诱饵或者猎物蛋白结构域，因为酵母表达系统是真核系统，表达的蛋白是具有结构的非线性的构象，如果蛋白分子量不大，可以采用诱饵和猎物蛋白两次串联方式的构建，或者某个重要结构域重复串联。

q:如果诱饵可以直接激活报告基因，该如何处理？

a:为保证诱饵蛋白功能的完整性，首先我们会考虑用3’at/aba进行背景抑制，但是由于这两种试剂对酵母生长具有较大的毒性，后续可能会影响文库筛选，因此在3’at超过15mm，aba超过1200ng/ml时我们会考虑将诱饵蛋白进行截断，通过查阅文献和相关数据库，截去转录激活的区域，需要注意的是，截去的这一部分很有可能会影响到互作结果。

q:酵母单杂诱饵启动子我该选择全长还是核心区域？

a:全长：优点：更接近于自然条件下的启动环境；缺点：有时候过于长，导致构建具有一定的难度，更可能的产生自激活现象；
预测的核心元件（<20bp）：优点：核心元件用于后续的emsa验证试验，对核心位点进行突变验证启动效果是否减弱，相对全长启动子而言突变的区域较少操作更为方便；缺点：核心元件虽然是启动的核心区域，但是启动子的其他区域也可能是作为辅助元件而存在的，如果缺少这些部分就是非自然条件下的环境，可能产生假阴性；

q:膜系统功能验证是怎么做？

a:nmy51(pbt3-n-bait post1-nubai)此为功能验证组，nubai为野生型的ubiquitin的n端结构，保留了原始的三个i氨基酸结构，可以在不需要两个蛋白产生相互作用的情况下两个c端和n端的ubiquitin结构域结合在一起产生具有功能的ubiquitin，从而激活下游的报告基因。结论：在二缺平板上正常生长，说明共转化成功，并在缺陷tdo x-a-gal的平板上显蓝色说明我们的bait构建的读码框正确（也就是我们构建的诱饵扩谱结构可以满足筛选的需要）。并且我们的ubiquitin系统是存在功能的。

q:膜蛋白酵母双杂交过程需要注意的问题与细节？

a:膜蛋白的筛选是采用共转化的方式进行的，筛选的假阳性率相对核蛋白的mating方式筛选假阳性率要低一些，但是共转化筛选对转化效率有要求，不然会产生假阴性。如果采用化学转化对感受态转化效率有一定的要求，至少达到10的4次方，感受态细胞的溶氧的提到（装液量不超过1/5）对感受态的效率提高有帮助。电转化感受态保存10%的甘油，转化参数800v,15m转化效率可以到10的5次方到6次方。

q:请给个预测靶蛋白的网站，植物。

a:

q:相对其他公司而言，金开瑞在酵母杂交业务上具有什么样的优势？

a:从文库构建来说：
文库构建方式灵活：根据样本的类型，提供的样本量等方面考虑，可采用smart，geteway，infusion体外重组和t4体外连接等方式进行文库构建；
文库片段大小可控：根据客户想要研究的蛋白类型大小控制片段的大小，以提高筛选到目标蛋白的可能性。如白细胞介素，生长因子类的小分子蛋白；转录因子，信号通路类的分子量稍大一些的蛋白；
单双杂文库通用：构建一种类型的文库，可同时用于单双杂筛选；

对于文库筛选来说：
筛库方式多样：可采用matting或共转的方式进行文库筛选；
互作强弱可控化：提高（降低）筛选压力，用于筛选出强（弱）相互作用的蛋白。
阳性结果进一步验证：文库筛选出的阳性结果，可进行点对点验证进一步排除假阳性。

q:酵母杂交年末有活动吗？

a:有，建库、筛库、点对点都有活动，赶紧联系您的对接销售了解详情吧。
 

q:金开瑞所提到的三框文库和均一化文库具体指什么？与普通文库相比有什么优势吗？

a:三框：氨基酸对应三个密码子，文库中cdna的片段大小是随机的，读码框也是随机的，例如atg，有可能是从a开始翻译，也有可能是从t或g开始翻译，这种情况下就只会出现一个正确的读码，三框通过人为的引入一个和两个碱基，使每个移码的基因都能正确的被读出来，这样得到的文库即为一个相对较为完整。

均一化：组织样本中有些基因mrna含量会很高，而有些基因含量会很低。均一化主要是将高峰度的mrna通过人为的处理将其在总样本中的占比降下来，这样低丰度的mrna的占比自然就会升高。如果客户感兴趣的基因恰好属于低丰度mrna，那么在实现mrna的均一性后，文库筛选更有可能的筛出客户的目的功能基因。要注意的是均一化不建议用于研究特殊处理后的样本（如，病毒/细菌侵害，水胁迫等）。

q:进行酵母杂交文库筛选时得到的阳性结果，而进行点对点验证却出现阴性结果，是什么原因造成的呢？

a:可能有以下原因：

1) 酵母杂交本身也是存在假阳性的情况，有可能这两个基因根本不互作，这样在进行单独的点对点验证时自然也不会产生互作；

2) 有些互作为瞬时互作，在文库筛选时可能捕捉导了互作，而在两个基因进行单独验证时由于互作时间的原因，最终导致结果显示为阴性；

3) 有些互作为间接互作，可能需要依靠第三个基因的作用，促进这两个基因的互作。

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