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客户文章分享：番茄转录因子slhz24通过对d-8846威尼斯

信息来源：金开瑞 作者：genecreate 发布时间：2017-12-29 15:58:19

基本信息
题目：the tomato hd-zip i transcription factor slhz24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the d-mannose/l-galactose pathway
期刊：the plant journal
影响因子：5.901
实验技术：酵母单杂交、酵母双杂交、双萤光素酶检测、emsa、qpcr
合作技术：emsa
研究背景
       抗坏血酸（asa）是一种抗氧化剂，可以清除植物在胁迫条件下产生的活性氧。本文通过酵母单杂交技术、瞬时表达和emsa实验验证了slhz24和sigmp3启动子结合，且slhz24表达水平与asa积累呈正相关特性。相反，通过rnai技术导致asa表达量降低。slhz24同时也影响d-甘露糖/l半乳糖通路其他基因的表达，比如sigme2、siggp和sigmp4，说明抗坏血酸合成为多靶点调控。slhz24过表达植株对氧化应激的敏感性降低，作者推断slhz24促进抗坏血酸的合成，提高了植株对氧化应激的耐受性。
研究内容及结果
1. slhz24属于hd-zip i蛋白家族
       本文以维生素c合成主要途径d-mannose/l-galactose途径中关键gmp基因为切入点。gdp-d甘露糖焦磷酸化酶（gmp）在d-甘露糖/l半乳糖通路中扮演了很重要的角色，据报道gmp家族中只有过表达sigmp3提高了抗坏血酸的表达且改善了氧化应激耐受性。因此，本文使用酵母单杂交找寻与sigmp3启动子作用调节抗坏血酸的转录因子，共找到25个潜在蛋白，确认slhz24 为研究对象。序列分析显示slhz24含有hd和lz结构域（图1a），且与其他hd-zip i蛋白高度同源（图1b）。进化分析的结果也说明slhz24与拟南芥的hd-zip i蛋白同源。因此，slhz24属于hd-zip i蛋白。
2. 酵母双/单杂交验证slhz24反式激活作用
       使用酵母双杂交实验验证了slhz24反式激活，含pbd-slhz24的实验组可以在sd/–trp–his–ade平板上生长，而对照组不能生长（图2a）。使用酵母单杂交实验验证了不同长度slhz24和sigmp3启动子的作用，其中slhz24全长、n3、n4、n5、n6、n7包含hd结构域表现为正常生长，n1不包含hd结构域表现为细胞不生长，n2包含不完整的hd结构域表现为生长缓慢，说明hd结构域为互做结构域（图2a）。
3. 瞬转及双萤光素酶检测验证slhz24与slgmp3启动子结合
       将slgmp3启动子分成4段进行双萤光素酶检测实验（图3a、3b），p1和p2启动子区域检测到荧光增强，实验结果说明slhz24结合slgmp3启动子的第二段序列，即-2411到-2313bp为结合区段。
4．进一步实验验证slhz24和slgmp3结合
       使用酵母单杂交实验验证不同的slgmp3启动子和slhz24的结合情况（图4a），结果显示slhz24蛋白与slgmp3启动子的结合位点为-2411到-2313bp，突变实验也证明了这个结果（图4b）。emsa实验进一步证明了该结论（图4c）。这些结果表明slhz24直接与slgmp3的上游元件结合来启动下游表达。
5. 不同番茄组织及转基因番茄中slgmp3和slhz24检测
       使用qpcr对番茄不同组织中的slgmp3启动子和slhz24的表达量进行了检测，发现两者都在茎和叶总的表达量较高（图5a），说明slhz24正向调节slgmp3表达。为了验证slhz24对slgmp3的影响，分别建立的slhz24过表达和干扰转基因番茄进行下一步实验（图5b）。
6. slhz24通过调节slgmp3表达来改变asa的合成
       对过表达、干扰番茄叶及果实中asa的检测（图6a 、6b）实验，说明slhz24在番茄叶和果实中同时调节抗坏血酸的合成。过表达slhz24的ox-13植株果实中slgmp3基因的表达量明显高于野生型，而干扰slhz24的kd-9植株果实中slgmp3基因的表达量变化不大（图6d）。有趣的是在干扰slhz24的植株叶子中slgmp3基因的表达量显著减少，而过表达slhz24的植株叶子中slgmp3基因的表达量变化不大（图6c）。对转基因番茄中其他gmp家族基因的检测结果说明slhz24可能调节多种sigmp基因（图6c、图6d）。
7. 番茄中asa和slgmp3检测
        为了检测番茄果实成熟过程中slhz24如何影响slgmp3，对不同时期果实的asa和slgmp3表达量进行了检测（图7a、7b），结果表明slhz24在番茄成熟的过程中可以调节slgmp3的表达，其中以破色期果实调控效应最为显著，除了红果实成熟期。
8. slhz24转基因番茄中d-甘露糖/l半乳糖通路其他基因的表达检测
        使用qpcr对番茄的叶和果实进行了检测（图8a、8b），结果表明在野生型和转基因番茄中sigme2、siggp基因表达量发生了改变，显示slhz24的多点协同调控作用。
9. sigme2、siggp启动子实验
        使用emsa实验验证转录因子slhz24和启动子sigme2、siggp有互做关系。
10. slhz24光响应及氧化应激的作用
        为了研究光对asa的作用，作者对不同光处理番茄中的asa和sihz24的表达量进行了检测（图10a、10b），结果表明sihz24可以被光激活且asa的表达也随之提高。使用mv对转基因番茄进行处理，同时对叶绿素和mda浓度进行检测，说明sihz24过表达可以提高植物对氧化应激的耐受性。
文章小结
    目前植物合成asa基础途径已经明确，但对asa合成代谢的调控机制知之甚少。本文研究了番茄转录因子slhz24结合sigmp3启动子从而增加asa表达水平的机制，进而提高植物对氧化应激的耐受性。asa（又称维生素c），是生物体一类小分子抗氧化剂物质，能清除体内活性氧，增强有机体抗氧化能力，保证新陈代谢的正常进行。不过人类自身不能合成维生素c，必须从食物中摄取。本研究首次发现调控果实asa积累的转录因子，对揭示asa调控机制和未来品质改良具有重要意义。
解析文献
tixu hu, jie ye, peiwen tao, et al.the tomato hdzip i transcription factor slhz24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the d-mannose/l-galactose pathway.the plant journal (2016) 85, 16–29.
参考文献
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